Summary
ここで、我々は、骨格筋芽細胞を含むコラーゲンベースの、組織構造の作製を実証する。これらの3次元設計された構造は、組織を交換または修復するために使用されることがあります
Abstract
電子ペースメーカーは、医療機器を救命しているという事実にもかかわらず、小児患者における長期的なパフォーマンスは、子供の小さいサイズと彼らの必然的な成長により課される制限には問題によりすることができます。その結果、心臓のリズム障害を有する小児患者のために特別に設計された革新的な治療のための真の必要性がある。我々は提案することを含むコラーゲンベースのマトリックスで構成される導電性の生物学的代替細胞が良く、成長に適応再発手術の必要性を削減し、大幅にこれらの患者の生活の質を向上させることができるautologously由来。本研究では、我々は、ファッションにハイドロゲルマトリックス内に心臓の上部および下部チャンバーの間の電気コンジットとして動作する外科的に移植可能な組織構造を主骨格筋芽細胞の細胞培養を組み込むための手順を説明します。最終的に、我々は、完全心ブロック児の房室の電気伝導を復元するために設計された組織のこのタイプを使用して期待しています。そのビューでは、我々は、確立されたプロトコルの修正バージョンを使用して、ラミニンコートした組織培養皿の上に新生児のLewisラットやプレート、それらの骨格筋から筋芽細胞を分離
Protocol
パート1：鋳型を構築アセンブル
- シリコンチューブ（VWR）を半減、3 cmの長さの部分にカットするためにカミソリの刃を使用してください。
- チューブの各端の内側にインプラントグレードのRTVシリコーン接着剤（ローディア社）のドロップを置きます。
- すぐにシリコーン接着剤のドロップにポリエステルメッシュ（マクマスター - カー）の小片（1センチメートル× 1cmを）置き、チューブの端に合わせて取り付けます。これは、構造、添付ファイルのためのわずかに隆起し、平坦な表面を提供します。もう一方の端について、この手順を繰り返します。
- 金型は3日間室温で乾燥することができます。これらは基本的に使い捨てなので、時間20〜30金型を作っておくと便利です。
- 接着剤が完全に乾燥したら、必要になるまで、70％エタノールを入れたビーカー内でこれらの型を格納します。このステップでは、カビを殺菌するのに役立ちますし、完成品を図1に示されています。
パート2：筋芽細胞を分離するための準備
- 250に1 mgのラミニン（シグマ）を希釈液0.22μmのはフィルター滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）は、1％ペニシリン/ストレプトマイシン（Invitrogen社）と1％のFungizone（Invitrogen）を含む。
- 4手順1.1から希釈ラミニン溶液1mlと主要骨格筋芽細胞を播種する前に少なくとも4時間、37℃でインキュベートするとコート150mmの組織培養プレート（BDファルコン）。
- （20％FBS（アトランタバイオロジカル）、5 ng / Lの塩基性線維芽細胞増殖因子（プロメガ社製）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン（Invitrogen社）、及び1％FungizoneとハムのF - 10栄養混合物（Sigma）を混合することにより、筋芽細胞の培地を作るインビトロジェン）。
- 100mLの2.4 U / mLのディスパーゼ- 2（Roche社）で〜295 U / mgのコラゲナーゼ2（ワーシントン）1gを溶解することにより骨格筋の消化溶液を調製。 0.037グラムのCaCl 2を加え、よく混ぜる。 -20℃で10mLのシリンジとストアのアリコートに装着0.2μmのフィルターディスクを使用して消化バッファーを滅菌フィルタリング° C筋芽細胞のメディアと一緒に37組織の消化に必要な量を置きます。
パート3：骨格筋からの筋芽細胞の分離
- 鉗子と小さなハサミを用いて、脊髄に沿って背中を下にスライス皮膚と筋膜層に戻って剥離し、筋肉を切り出すことによりデッド新生児Lewisラットから傍脊柱筋を取り除く。
- 組織培養フードの中で、氷上で1 ×ハンクス平衡塩溶液の40 mLの（HBSS）（Invitrogen社）を充填した50mLのコニカルチューブ（BDファルコン）で摘出した筋肉を置きます。筋肉片がチューブの底に沈降し、慎重に文化のフード（ベイカー）で滅菌パスツールピペットを用いて真空吸引によって液と血液の残りの大部分を除去することができます。
- 150 mmの培養皿上に回収筋肉片を注ぎ、吸引で可能な限り残留液をできるだけ多く削除します。 2個のシングル両刃かみそりの刃を使用すると、厚いペースト状に組織をミンチ。ペーストを予め温め消化溶液を注ぐと10 mLのピペットを使用して新鮮な50 mlチューブに混合物を移す。酵素消化中に、組織は時折コードレスピペットエイド（ドラモンド）の上に取り付けた10 mLのピペットを用いて（バブリングなし）摩砕しています。再び、組織が余分な液体を解決し、削除することができます。
- ロッキングプラットフォーム上にチューブを置き、約30分間37℃で消化。
- 筋肉が液化されると、600 XG（ベックマンGP）で10分間室温で70μmのセルストレーナー（BDファルコン）と遠心分離によるソリューションを渡します。パスツールピペットや吸引で、できるだけ液体の限りを削除し、暖かい筋芽細胞の培地の10mLでペレットを再懸濁します。
- プレ板15分間コーティングされていない150mmの組織培養プレート上で細胞が線維芽細胞を取り除く手助けをする。
- まだラミニンコートculturewareに接続されていると、1〜2仔ラット用のプレートがあるように希釈していないセルを転送する。 37 ° Cで5％CO 2の加湿インキュベーターセットにプレートを置きます。
第4部：鋳造工学、組織構造（5mL）を
- 1〜2日後、、インキュベーターから150 mmの筋芽細胞の組織培養プレートの10を削除して37℃の1 × PBSで2回それらを洗い流して、各プレートに温かい0.05％トリプシン- EDTAを4mLを追加します。 5分間インキュベーターにプレートを返します。
- 文化のフードにプレートから分離された筋芽細胞を収穫し、50 mlチューブ（BDファルコン）で液体を集める。プレートのすべてをリンスし、遠沈管内の細胞とこれを組み合わせることが筋芽細胞の培地10mLを使用してください。ペレットは600 xgで10分間室温で細胞（ベックマンGP）と、ステップ3.5で説明したように余分な液体を取り除く。
- 氷の上に筋芽細胞の培地と場所溶液1.6mLに筋芽細胞を再懸濁します。
- 鉗子を使用して、慎重にステップ1.5から4構造の金型を削除し、1X PBSで2回、それらを洗い流してください。 6ウェル組織のCuの各金型を配置する前にパスツールピペットでPBSのすべての痕跡から真空吸引ltureプレート（BDファルコン）。
- 氷の上に構造の準備に必要な他の試薬 を（10XハムのF10、抗生物質、1型コラーゲン[3.9 mg / mLの] [6]およびマトリゲル™）を収集し、37℃での筋芽細胞のメディアを保持する100μLペニシリン/ストレプトマイシン、100μLFungizone、1.6 mLのコラーゲン、15 mLコニカルチューブに750μLのマトリゲル™、500μL10XハムのF10を組み合わせる。 10秒、氷の上を10に設定ミニボルテックス（VWR）と場所を使用するためのソリューションを混ぜる。
- 次に、ステップ3.5からステップ3.3から混合物を80のNaHCO 3のμLと筋芽細胞懸濁液を加える。 10秒間ボルテックスする全体の混合物を、気泡のソリューションをクリアするために数分間、氷のバケツにチューブを返します。
- それは10 mLのピペットを用いて固化し始める前に、金型に混合物を慎重にキャスト。各金型は、粘性液体の約1 mLを開催します。この手順の実行中に気泡を導入しないようにしてみてください。
- インキュベーターにキャストの構文を含むプレートを慎重に移す。 〜30分後、インキュベーターから固化したコンストラクトを削除し、慎重に組織構築をカバーするために各ウェルに筋芽細胞の培地を加える。インキュベーターにプレートを返す（図2）。
パート5：代表的な結果
このプロトコルが正しく実行されると、筋芽細胞を含む組織の構造は、 生体移植のために（すなわち、金型から除去するとき）または2日後にin vitroでの解析でさらにできるようになります。
図1完成した構造型の例（ステップ1.5参照）。
図2。固化した筋芽細胞を含む組織には、[1]を構築する。
図3筋芽細胞を含む組織のH＆E染色切片の構築。 ""縦断面を表し、"B"は断面を示しています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
組織の構造がキャストされるの金型は、任意の形状と大きさで行うことができますが、添付ファイルの少なくとも2点がなければなりません。そうでなければ、マトリックスと細胞は球状構造を形成し、細胞が死ぬ。現在のプロトコルでは、我々はこの目的のためにポリエステルメッシュを使用することを記載し、まだ我々はまた、正常にステンレスメッシュを使用している。明らかに、より大きな金型は、より多くの細胞や他の成分の大きなボリュームが必要になります。金型を作るとき、それは使用されるシリコーン接着剤の量を最小限に抑えるために、それがチューブの非常に両端に配置されていることを確認することが重要です。接着剤に近い筋芽細胞は、さらに硬化の数日後、生きていけることではない傾向があるためです。さらに、それは汚染線維芽細胞が急速に増殖し、最終的には文化の筋原性成分を圧倒されるように組織構造を準備する前にだけ一日か二日のためのプレート筋芽細胞をすることが賢明です。互いに接触の細胞が融合して筋管に分化し始めるので、同様に、筋芽細胞が密に播種してはいけません。組織構造の製造に関しては、1型コラーゲンの市販のソースの数がありますが、それぞれの凝固の速度と最終製品の一貫性の違いを示しています。さらに、このプロセスは、ゲル化のプロセスを阻害するとして、コラーゲン製剤がUV光を照射されていないことが不可欠である。私たちの手で、構造は濃いピンクから凝固中に淡いピンクに色を変更。最後に、私たちのコラーゲン製剤は酸可溶化である（ペプシンは消化されない）、ステップ3.5ニーズの混合物のpHは、細胞を組み込む前にNaHCO 3を加えることによって増加するので。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
動物実験は、ボストン小児病院での動物実験使用の委員会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。
Acknowledgments
、スラッシャーの研究基金からの新しい研究賞、ボストン小児病院で心臓伝導基金への拠出、この作品は、国立衛生研究所から研究助成金（HL088206 HL068915）によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone tubing | VWR international | 60985-724 | |
| Silicone adhesive | Rhodia Silicones | MED ADH 4300 RTV | |
| Polyester Mesh | McMaster-Carr | 93185T17 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Nutrient Mixture F-10 HAM | Sigma-Aldrich | N6908 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Dispase-2 | Roche Group | 10295825001 | |
| Collagenase 2 | Worthington Biochemical | 46H8863 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Promega Corp. | G5071 | |
| 150 mm tissue culture dishes | BD Biosciences | 353025 | |
| 0.05% (1X) Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| 1X Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-112 | |
| 7.5% NaHCO3 | GIBCO, by Life Technologies | 25080-094 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 6-well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| 50 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352098 | |
| 15 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352099 | |
| 0.2 μm filter | Nalge Nunc international | 194-2520 |
References
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Blau, H. M., Webster, C. Isolation and characterization of human muscle cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).
- Powell, C. Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy. Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).
- Vandenburgh, H. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Gallop, P. M., Seifter, S. Preparation and Properties of Soluble Collagens. Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).
