Summary
在这里，我们展示了制造胶原蛋白为基础，组织骨骼肌成肌细胞构造。这些工程结构的3 - D可用于更换或修复组织
Abstract
尽管事实上，电子起搏器的寿命，节省了医疗设备，他们长期在儿科患者的表现可能会出现问题，由于孩子的小规模的和不可避免的增长所施加的限制。因此，真正需要的是一个专门设计的儿科患者心律紊乱的创新疗法的。我们提出一个含有胶原蛋白为基础的矩阵组成一个导电的生物替代autologously衍生细胞能更好地适应经济增长，减少经常性手术的需要，并大大提高这些患者的生活质量。在本研究中，我们描述了一种结合骨骼肌成肌细胞内的水凝胶矩阵的主要文化时尚手术植入的组织构造，将作为心脏的上下商会之间的电气管道的过程。最终，我们预计，使用这种类型的工程组织，以恢复完整的心脏传导阻滞的儿童房室导电。鉴于此，我们隔离新生儿Lewis大鼠和板到层粘连蛋白涂层的组织培养皿中，使用的既定协议的修改后的版本的骨骼肌成肌细胞
Protocol
第1部分：组装构建压铸模具
- 使用刀片硅胶管（VWR）减半，切成3厘米长的片。
- 油管两端的内侧放置一个植入级RTV硅酮胶（罗地亚）下降。
- 快速放置小块（1厘米× 1厘米）的聚酯丝网（麦克马斯特CARR）上的硅酮胶下降，并配合管端。这将提供一个微微凸起，平坦的表面构造附件。重复的另一端。
- 允许模具在室温下干燥3天。一次20到30的模具是非常有用，因为这些基本上是一次性的。
- 胶粘剂完全干燥后，储存在充满70％乙醇的烧杯，直到他们需要这些模具。这一步，将有助于消毒模具及成品，如图1所示。
第2部分：成肌细胞分离的制备
- 稀释1毫克层粘连蛋白（Sigma公司）在250毫升0.22微米过滤灭菌的磷酸盐缓冲液（PBS）含有1％青霉素/链霉素（Invitrogen公司）和1％Fungizone（Invitrogen公司）。
- 大衣150毫米组织培养皿（BD猎鹰）4步骤1.1 mL的稀释层粘连蛋白的解决方案和电镀前主骨骼肌成肌细胞在37℃孵育至少4个小时。
- 混合20％胎牛血清（亚特兰大生物），5毫微克/升基本的成纤维细胞生长因子（Promega公司），1％青霉素/链霉素（Invitrogen公司），和1％Fungizone火腿的F - 10营养合剂（Sigma公司）的成肌细胞培养基（ Invitrogen公司）。
- 溶解1克〜295 U /毫克胶原酶2 100毫升2.4 U / mL的Dispase - 2（罗氏）（顿），准备骨骼肌消化解决方案。添加0.037克氯化钙2拌匀。通过使用一个0.2微米的过滤器在-20 ° C到10毫升的注射器和存储等分装的磁盘的过滤消毒消化缓冲将组织消化在37 ° C，与成肌细胞媒体所需的数额。
第3部分：从骨骼肌成肌细胞隔离
- 使用镊子和小剪刀，除去死亡新生儿的Lewis大鼠椎旁肌肉切片沿脊髓背下来，脱皮的皮肤和筋膜层，然后切除的肌肉。
- 在组织培养罩，置于50 mL锥形管40毫升的1X汉克斯平衡盐溶液（HBSS）冰（Invitrogen）的填充（BD猎鹰）切除的肌肉。允许肌条定居到试管底部，小心地取出，用无菌的巴斯德吸管在文化遮光罩（贝克），真空吸液和血液残余。
- 到150毫米的培养皿中倒入收获的肌肉块，并删除剩余的液体吸可能。使用2个单刃刀片直言不讳地组织到稠糊状。预热消化解决方案，并倒上粘贴的混合物转移到一个新的50 mL试管，使用10毫升吸管。在酶消化，偶尔磨碎组织（不冒泡）10毫升装到一个无绳移液器援助（德拉蒙德）吸管。再次，让组织来解决和消除多余的液体。
- 广场上的摇摆平台管和消化约30分钟，在37 º C。
- 肌肉一旦液化，通过在室温下10分钟600 XG（美国贝克曼GP）的解决方案，通过一个70微米的细胞过滤器（BD猎鹰）和离心机。用巴斯德吸液管和吸，尽可能多的液体尽可能消除和10毫升温暖的成肌细胞培养基重悬沉淀。
- 板前未涂层的150毫米15分钟的组织培养板的细胞，以帮助消除成纤维细胞。
- 转让尚未连接层粘连蛋白涂层cultureware和稀释，以便有一个板块为每1至2幼鼠的细胞。在37℃，5％CO 2，放置在一个培养箱集板。
第4部分：铸造工程的组织结构（5毫升）
- 经过1〜2天，取出从孵化器的150毫米的成肌细胞组织培养板10，37℃1X PBS冲洗两次，并添加4毫升温暖的0.05％胰蛋白酶EDTA每块板。返回板块的孵化器，为5分钟。
- 收获在文化罩板分离成肌细胞，并收集在50毫升管的液体（BD猎鹰）。成肌细胞培养基用10毫升冲洗所有的板块，并结合在离心管中的细胞。颗粒细胞在室温为10分钟600 XG（美国贝克曼GP），除去多余的液体，在步骤3.5中所述。
- 成肌细胞重悬在1.6毫升的成肌细胞的培养基，并置于冰上。
- 使用镊子，小心地取出1.5步骤4构造的模具，用1X PBS冲洗两次。关闭所有与巴斯德吸管的PBS的痕迹，然后放置在一个6孔组织立方米每个模具的真空吸lture板（BD猎鹰）。
- 上冰收集的其他建设准备所需的试剂（10X火腿的F10键，抗生素，1型胶原[3.9毫克/毫升] [6]和基质胶™），并保持在37℃的成肌细胞的媒体联合收割机500μL，10X火腿的F10键，100μL青霉素/链霉素，100μLFungizone，1.6毫升的胶原蛋白，在15 mL锥形管和750μL基质胶™。 10秒使用小型Vortexer（VWR）设置为10和地点上的冰混合的解决方案。
- 接下来，添加80μL碳酸氢钠3和步骤3.3中的成肌细胞悬液的混合物从步骤3.5。涡整个混合物为10秒，返回管冰桶，几分钟，以清除气泡的解决方案。
- 我们小心地撒入模具混合，然后才开始巩固使用10毫升吸管。每个模具将举行约1毫升的粘稠液体。尽量避免在此过程中引入的气泡。
- 小心地转移包含铸铁构造板块的孵化器。约30分钟后，从孵化器中取出的凝固结构和仔细添加成肌细胞培养基，每孔盖组织结构。返回板的孵化器（图2）。
第5部分：代表结果
当正确执行，这个协议是在体内植入的成肌细胞中的组织构造（即从模具中删除时） 或进一步在体外分析，术后第2天。
图1。完成兴建模具（见步骤1.5）。
图2凝固成肌细胞中的组织构造[1] 。
图3。一个成肌细胞含组织的H＆E染色切片构造。 “”描绘了一个纵向节和“B”显示了一个横截面。
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Discussion
在其中的组织构造将铸模可在任何形状和大小，但需要有至少有两个附着点。否则，基质和细胞形成一个球形结构和细胞死亡。在本议定书中，我们描述了一个用于此目的的聚酯网的使用，但我们也成功地应用于不锈钢网。显然，规模较大的模具将需要更多的细胞和其他成分的体积较大。当模具，重要的是尽量减少使用硅酮胶量，以确保它是在位于油管非常两端。这是因为附近的胶粘剂的成肌细胞往往不是可行的，甚至固化后的数天，。此外，它是审慎板只有一两天的成肌细胞前准备的组织结构，污染成纤维细胞会迅速繁殖，并最终压倒生肌文化的组成部分。同样，成肌细胞不应该被镀密集，因为在相互接触的细胞就会开始融合和分化成肌管。在组织结构的制造方面，有1型胶原的商业来源，但是，每个展示的凝固速度和最终产品的一致性的差异。此外，它是必不可少的胶原蛋白，准备不紫外灯照射，因为这个过程中抑制凝胶过程。在我们的手中，结构变化的颜色从暗粉色在凝固过程中的一个浅粉色。最后，我们的胶原蛋白制备酸solublized（不是胃蛋白酶的消化），所以在步骤3.5需求的混合物的pH值， 加入碳酸氢钠，然后再结合细胞3增加。
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Disclosures
机构动物护理和使用委员会在波士顿儿童医院的规定的准则和法规的规定进行了动物实验。
Acknowledgments
这项工作是由来自美国国立卫生研究院的研究补助金（HL068915 HL088206），从长尾研究基金的研究员奖，并在波士顿儿童医院的心脏传导基金捐款支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone tubing | VWR international | 60985-724 | |
| Silicone adhesive | Rhodia Silicones | MED ADH 4300 RTV | |
| Polyester Mesh | McMaster-Carr | 93185T17 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Nutrient Mixture F-10 HAM | Sigma-Aldrich | N6908 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Dispase-2 | Roche Group | 10295825001 | |
| Collagenase 2 | Worthington Biochemical | 46H8863 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Promega Corp. | G5071 | |
| 150 mm tissue culture dishes | BD Biosciences | 353025 | |
| 0.05% (1X) Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| 1X Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-112 | |
| 7.5% NaHCO3 | GIBCO, by Life Technologies | 25080-094 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 6-well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| 50 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352098 | |
| 15 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352099 | |
| 0.2 μm filter | Nalge Nunc international | 194-2520 |
References
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Blau, H. M., Webster, C. Isolation and characterization of human muscle cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).
- Powell, C. Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy. Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).
- Vandenburgh, H. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Gallop, P. M., Seifter, S. Preparation and Properties of Soluble Collagens. Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).
