Summary
Hier zeigen wir die Herstellung von Kollagen-basierten, baut Gewebe mit Skelettmyoblasten. Diese 3-D konstruiert Konstrukte verwendet zu ersetzen oder zu reparieren Gewebe werden
Abstract
Trotz der Tatsache, dass die elektronische Herzschrittmacher sind lebensrettende medizinische Geräte, deren langfristige Performance bei pädiatrischen Patienten kann problematisch wegen der Einschränkungen durch ein Kind seiner geringen Größe und ihrer unvermeidlichen Wachstum auferlegt werden. Folglich gibt es einen echten Bedarf an innovativen Therapien speziell für pädiatrische Patienten mit Herzrhythmusstörungen entwickelt. Wir schlagen vor, dass eine leitende biologische Alternative, bestehend aus einer Kollagen-basierten Matrix mit autologen-abgeleiteten Zellen könnte besser zum Wachstum anzupassen, reduzieren die Notwendigkeit für wiederkehrende Operationen, und verbessern Sie die Qualität des Lebens für diese Patienten. In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Verfahren zur Einbindung primären Skelett Myoblasten Zellkulturen in einem Hydrogel-Matrix der Mode eine chirurgisch-implantierbaren Gewebe zu konstruieren, das als elektrische Leitung zwischen dem oberen und unteren Kammern des Herzens dienen. Letztlich erwarten wir mit dieser Art von gezüchteten Gewebe zu atrioventrikulären elektrische Leitfähigkeit bei Kindern mit komplettem Herzblock wiederherzustellen. In Anbetracht dieser, isolieren wir Myoblasten aus der Skelettmuskulatur von neonatalen Lewis Ratten und Platte sie auf Laminin-beschichtete Gewebe Kulturschalen mit einer modifizierten Version des etablierten Protokollen
Protocol
Teil 1: Montieren Sie bauen Gussformen
- Verwenden Sie eine Rasierklinge Silikonschlauch (VWR) zu halbieren und schneiden Sie es in 3 cm lange Stücke schneiden.
- Geben Sie einen Tropfen von Implantat-grade RTV Silikonkleber (Rhodia) auf der Innenseite von jedem Ende des Schlauchs.
- Schnell Ort ein kleines Stück (1 cm x 1 cm) von Polyester-Mesh (McMaster-Carr) auf dem Silikonkleber drop und richten Sie sie mit dem Ende des Schlauchs. Dies wird eine leicht erhöhte und ebene Fläche für Bau Anhang. Wiederholen Sie für das andere Ende.
- Lassen Sie die Form bei Raumtemperatur für 3 Tage trocknen lassen. Es ist hilfreich, 20 bis 30 Formen in einer Zeit zu machen, da diese im Wesentlichen zu entsorgen sind.
- Sobald der Kleber vollständig trocken ist, speichern diese Formen in ein Becherglas mit 70% Ethanol gefüllt, bis sie gebraucht werden. Dieser Schritt wird dazu beitragen, sterilisieren die Formen und das fertige Produkt wird in Abbildung 1 dargestellt.
Teil 2: Vorbereitung für die Myoblasten Zellisolation
- Verdünnen Sie 1 mg Laminin (Sigma) in 250 ml 0,22 um Filter-sterilisierte Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) mit 1% Penicillin / Streptomycin (Invitrogen) und 1% Fungizone (Invitrogen).
- Coat 150 mm Zellkulturplatten (BD Falcon) mit 4 ml der verdünnten Laminin-Lösung aus Schritt 1,1 und bei 37 º C für mindestens 4 Stunden vor dem Ausplattieren der primären Skelettmyoblasten.
- Machen Sie den Myoblasten Medium durch Mischen Hams F-10 Nutrient Mixture (Sigma) mit 20% FBS (Atlanta Biologicals), 5 ng / L basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (Promega), 1% Penicillin / Streptomycin (Invitrogen) und 1% Fungizone ( Invitrogen).
- Bereiten Sie die Skelettmuskulatur Verdauung durch Auflösen von 1 g ~ 295 U / mg Collagenase 2 (Worthington) in 100 ml 2,4 U / ml Dispase-2 (Roche). Add 0,037 g CaCl 2 und gut mischen. Filter sterilisieren die Verdauung Puffer durch einen 0,2 um Filter Festplatte auf eine 10 ml Spritze und speichern Aliquots bei -20 ° C eingebaut Setzen Sie den Betrag für die Gewebe-Verdau bei 37 ° C zusammen mit den Myoblasten Medien benötigt.
Teil 3: Myoblasten isoliert von der Skelettmuskulatur
- Mit einer Pinzette und eine kleine Schere, zu entfernen paraspinalen Muskeln von toten Neugeborenen Lewis Ratten durch Aufschneiden den Rücken hinunter entlang des Rückenmarks, Abziehen der Haut und Faszie Schichten und dann Ausschneiden der Muskeln.
- In einer Gewebekultur Kapuze, platzieren Sie den ausgeschnittenen Muskeln in einem 50 ml konischen Röhrchen (BD Falcon) mit 40 ml 1X Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Invitrogen) auf Eis gefüllt. Lassen Sie den Muskel-Streifen auf den Boden des Röhrchens absetzen und entfernen Sie vorsichtig die meisten der Flüssigkeit und Blut Überreste von Vakuumsauger mit einer sterilen Pasteurpipette in eine Kultur Haube (Baker).
- Gießen Sie die geernteten Muskel Stücke auf einer 150 mm Kulturschale und entfernen Sie so viel von der restlichen Flüssigkeit wie möglich abgesaugt. Mit 2 einseitig geschliffene Klingen zerkleinern das Gewebe zu einer dicken Paste. Gießen vorgewärmten Verdauung Lösung auf der Paste und die Masse in eine frische 50 ml Tube mit einem 10-ml-Pipette. Während der enzymatischen Verdauung, wird das Gewebe gelegentlich verrieben (ohne Blasenbildung) mit einer 10 mL Pipette auf ein schnurloses Pipette-Aid (Drummond) ausgestattet. Auch hier ermöglichen das Gewebe ansiedeln und entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit.
- Das Röhrchen auf einem Schaukelstuhl Plattform und verdauen bei 37 º C für ca. 30 min.
- Sobald der Muskel wird verflüssigt, übergeben Sie die Lösung durch einen 70 um Zellsieb (BD Falcon) und Zentrifuge bei Raumtemperatur für 10 min bei 600 xg (Beckman GP). Mit einer Pasteurpipette und Absaugung, entfernen Sie so viel von der Flüssigkeit wie möglich und das Pellet mit 10 ml warmem Myoblasten Medium.
- Pre-Platte die Zellen auf einer unbeschichteten 150 mm Gewebekulturplatte für 15 Minuten zur Beseitigung von Fibroblasten.
- Übertragen Sie die Zellen, die noch nicht auf die Laminin-beschichtete cultureware befestigt und verdünnen, so dass es eine Platte für jede von 1 bis 2 Rattenbabys. Die Platte wird in einem befeuchteten Inkubator eingestellt bei 37 ° C mit 5% CO 2.
Teil 4: Casting gezüchteten Gewebe-Konstrukten (5 mL)
- Nach 1 bis 2 Tagen, entfernen 10 der 150 mm Myoblasten Zellkulturplatten aus dem Inkubator, spülen Sie sie zweimal mit 37 ° C 1X PBS, und fügen Sie 4 ml warmes 0,05% Trypsin-EDTA auf jeder Platte. Bringen Sie die Platten in den Inkubator für 5 min.
- Ernte der abgelösten Myoblasten aus den Platten in der Kultur Kapuze und sammeln die Flüssigkeit in einer 50 ml Tube (BD Falcon). Verwenden Sie 10 ml Myoblasten mittel-bis alle Platten Spül-und kombinieren diese mit den Zellen in die Zentrifugenröhrchen. Pellet die Zellen bei Raumtemperatur für 10 min bei 600 xg (Beckman GP) und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit wie in Schritt 3.5 beschrieben.
- Resuspendieren Myoblasten Zellen in 1,6 ml Myoblasten Medium und auf Eis stellen.
- Mit einer Pinzette vorsichtig Entfernen 4 konstruieren Formen aus Schritt 1.5 und spülen Sie sie zweimal mit 1X PBS. Vakuum-Sauggreifer aus alle Spuren von PBS mit einer Pasteurpipette, bevor jeder Form in einer 6-well Gewebe culture Platte (BD Falcon).
- Sammeln Sie die anderen Reagenzien für Bau Vorbereitung nötig (10X Hams F10, Antibiotika, Typ-1-Kollagen [3,9 mg / mL] [6] und Matrigel ™) auf Eis und halten Myoblasten bei 37 º C. Kombinieren Sie 500 ul 10x Ham F10, 100 ul Penicillin / Streptomycin, 100 ul Fungizone, 1,6 mL Kollagen, und 750 ul Matrigel ™ in ein konisches 15 ml Tube. Mischen Sie die Lösung für 10 sec mit einem Mini-Vortexer (VWR) auf 10 und auf Eis stellen.
- Anschließend fügen Sie 80 ul von NaHCO 3 und die Myoblasten Suspension aus Schritt 3,3 bis die Mischung aus Schritt 3.5. Vortex die gesamte Mischung für 10 sec und kehren der Röhre in den Eiskübel für ein paar Minuten, um die Lösung von Bläschen klar.
- Vorsichtig warf das Gemisch in die Formen, bevor sie sich verfestigen mit einer 10 ml Pipette beginnt. Jede Form hält ca. 1 mL der viskosen Flüssigkeit. Versuchen Sie zu vermeiden Einführung von Luftblasen während dieses Vorgangs.
- Sorgfältig Übertragung der Teller mit der cast Konstrukte in den Inkubator. Nach ca. 30 min, entfernen Sie die erstarrten Konstrukte aus dem Inkubator und vorsichtig Myoblasten Medium in jede Vertiefung zur Deckung des Gewebes zu konstruieren. Bringen Sie die Platte in den Inkubator (Abbildung 2).
Teil 5: Repräsentative Ergebnisse
Wenn dieses Protokoll korrekt ausgeführt wird, wird die Myoblasten-haltigen Gewebe konstruieren bereit für in vivo-Implantation (dh, wenn aus der Form entfernt) oder für weitere in vitro-Analysen nach 2 Tagen.
Abbildung 1. Beispiele für abgeschlossen zu konstruieren Formen (siehe Schritt 1.5).
Abbildung 2. A verfestigt Myoblasten-haltigen Gewebe konstruieren [1].
Abbildung 3. H & E gefärbten Schnitten eines Myoblasten-haltigen Gewebe zu konstruieren. "A" zeigt einen Längsschnitt und "B" zeigt einen Querschnitt.
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Discussion
Die Formen, in denen das Gewebe konstruieren gegossen werden kann in jeder Form und Größe hergestellt werden, allerdings muss es mindestens zwei Befestigungspunkte werden. Ansonsten bilden die Matrix und Zellen eine kugelförmige Struktur und die Zellen sterben. In der vorliegenden Protokoll, beschreiben wir die Verwendung eines Polyester-Mesh für diesen Zweck, aber wir haben auch erfolgreich Edelstahlgewebe verwendet. Offensichtlich werden größere Formen erfordern mehr Zellen und ein größeres Volumen der sonstigen Bestandteile. Bei der Herstellung der Formen, ist es wichtig, die Menge der Silikonkleber verwendet zu minimieren und sicherzustellen, dass sie an den Enden des Rohres befindet. Dies liegt daran, Myoblasten in der Nähe der Klebstoff nicht lebensfähig zu sein, auch nach mehreren Tagen der Heilung neigen. Darüber hinaus ist es ratsam, Platte die Myoblasten für nur ein oder zwei Tage vor der Herstellung der Gewebe-Konstrukten als Verunreinigung Fibroblasten rasch vermehren wird und schließlich überwältigen die myogene Komponenten der Kultur. Ebenso sollte Myoblasten nicht dicht überzogen werden, da die Zellen in Kontakt miteinander beginnen zu verschmelzen und differenzieren sich in Myotuben. In Bezug auf die Herstellung der Gewebe-Konstrukten, gibt es eine Reihe von kommerziell verfügbaren Quellen von Typ-1-Kollagen, jedoch zeigen jeweils Unterschiede in der Rate der Erstarrung und die Konsistenz des Endproduktes. Darüber hinaus ist es wichtig, dass die Kollagen-Präparat nicht mit UV-Licht bestrahlt, wie dieser Prozess hemmt die Gelierung. In unseren Händen, ändern Sie die Konstrukte Farbe aus einer dunkelrosa eine hellrosa während der Erstarrung. Schließlich unserer Kollagenpräparat Säure-solubilisiert wird (nicht Pepsin verdaut), so den pH-Wert der Mischung in Schritt 3.5 muss durch Zugabe von NaHCO 3 vor Aufnahme der Zellen erhöht werden.
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Disclosures
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die Institutional Animal Care und Verwenden Ausschusses im Kinderkrankenhaus Boston gesetzt durchgeführt.
Acknowledgments
, Ein New Researcher Award vom Thrasher Research Fund, und Beiträge an die Reizleitung Fund an der Kinderklinik Boston; Diese Arbeit wird durch Forschungsmittel von den National Institutes of Health (HL088206 HL068915) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone tubing | VWR international | 60985-724 | |
| Silicone adhesive | Rhodia Silicones | MED ADH 4300 RTV | |
| Polyester Mesh | McMaster-Carr | 93185T17 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Nutrient Mixture F-10 HAM | Sigma-Aldrich | N6908 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Dispase-2 | Roche Group | 10295825001 | |
| Collagenase 2 | Worthington Biochemical | 46H8863 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Promega Corp. | G5071 | |
| 150 mm tissue culture dishes | BD Biosciences | 353025 | |
| 0.05% (1X) Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| 1X Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-112 | |
| 7.5% NaHCO3 | GIBCO, by Life Technologies | 25080-094 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 6-well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| 50 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352098 | |
| 15 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352099 | |
| 0.2 μm filter | Nalge Nunc international | 194-2520 |
References
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Blau, H. M., Webster, C. Isolation and characterization of human muscle cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).
- Powell, C. Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy. Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).
- Vandenburgh, H. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Gallop, P. M., Seifter, S. Preparation and Properties of Soluble Collagens. Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).
