Живая съемка Плотные-ядерные Пузырьки в начальной культивированный нейронов гиппокампа

Summary

Живая клетка изображений имеет особую полезность при изучении динамики торговли органелл. Здесь мы опишем протокол для живого изображения плотных процессоров пузырьки в культуре нейронов использованием широкого поля флуоресцентной микроскопии. Этот протокол является гибкой и может быть адаптирована для изображения других органелл типа митохондрий, эндосомы и пероксисом.

Abstract

Наблюдение и характеризующих динамическую клеточных процессов может дать важную информацию о клеточной активности, которые не могут быть получены из статических изображений. Vital флуоресцентных зондов, особенно зеленый флуоресцентный белок (GFP) произвели революцию клеточной биологии, вытекающих из способности этикетке конкретного внутриклеточные отсеки и клеточных структур. Например, жить изображений GFP (и его спектральный варианты) химерами позволили динамического анализа цитоскелета, органелл транспорта и мембраны динамика во множестве организмов и типов клеток [1-3]. Хотя жить изображений стала распространенной, этот подход до сих пор вызывает много технических проблем, особенно в начальной культурный нейронов. Одной из проблем является выражением GFP с метками белков в пост-митотического нейроны, а другая возможность захвата флуоресцентные изображения при минимальном фототоксичности, фотообесцвечивания, а также поддержание общего здоровья клеток. Здесь мы предлагаем протокол, который описывает на основе липидов трансфекции метод, который дает относительно низкий уровень трансфекции (~ 0,5%), однако идеально подходит для визуализации полностью поляризованных нейронов. Низкий уровень трансфекции важно, чтобы один аксонов и дендритов может быть охарактеризована как их ориентации в тело клетки, чтобы подтвердить направленность транспорта, т.е., антероградная против ретроградной. Наш подход к визуализации GFP выражения нейронов зависит от стандартного широкого поля флуоресцентный микроскоп оснащен ПЗС-камеры, программное обеспечение захвата изображения, а также подогревом камеры изображений. Мы отображаемого разнообразных органелл или сооружений, например, плотной основной пузырьков, митохондрий, конусы роста, и актин без каких-либо специальной оптики или возбуждения условий, отличных от флуоресцентных источников света. Кроме того, спектрально-различны, флуоресцентно меченых белков, например, GFP и DsRed с метками белки, могут быть визуализированы возле одновременно для характеристики со-транспортных и иных скоординированных клеточных событий. Изображения Описанный здесь подход является гибким для различных приложений и изображения могут быть приняты лаборатории при относительно небольших затратах при условии, микроскоп доступен.

Protocol

Часть 1: Трансфекция нейронов использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen)

Оборудование установки:

Крыса или мышь нейронов гиппокампа культивируются в соответствии с Kaech и банкир, 2006 [4]. Типичная плотность клеток используется для трансфекции является 250000 cells/6-cm блюдо. Обязательные реактивов и оборудования включают 50 мМ кинуреновой кислоты, регулярные держатель трубки настольный, настольный кулер (лучше держать Lipofectamine холодной реагентов),
Lipofectamine реагента, MEM, микроцентрифужную трубы, micropipetters, и стерильных щипцов.

Порядок действий:

1. Для каждой трансфекции этикетке два 1,5 мл трубы, одна содержит ДНК плазмиды, один, чтобы содержать трансфекции реагента. Следующие инкубации могут протекать при комнатной температуре.
   1. Комбинат 1,0 мкг плазмидной ДНК с 100 мкл MEM в одной трубе (без добавки любого типа; MEM не должны быть температура рН уравновешенной).
   2. Комбинат 6,0 мкл Lipofectamine с 100 мкл MEM в другом 1,5 мл трубки.
      1. Нет корректировки для двойного трансфекции требуется хотя Lipofectamine: ДНК соотношение будет два раза в таких случаях. Отношение Lipofectamine: ДНК все еще в пределах предложение производителя. Лучше всего, чтобы проверить 0,5-1,0 мкг для каждой плазмиды для оптимального выражения.
      2. Для сохранения срока годности Lipofectamine реагент, она должна быть удалена из холодильника течение столь же короткого времени насколько возможно и помещены в настольный кулер, когда он не используется.
         Общее время из холодильника должно быть сведено к минимуму.
2. Инкубировать пробирки в течение 5 минут при комнатной температуре.
3. Передача ДНК-в-MEM раствора в липидных трубки и осторожно смешать с пипетки, а затем инкубировать 30 минут при комнатной температуре.
4. После 25 минут, прежде, чем щелкнуть покровные стекла, добавить 60 мкл 50 мМ кинуреновой кислоты, чтобы минимизировать ущерб excitoxic блюдо культурный нейронов.
   1. Аккуратно переверните покровные ноги стороной вверх использованием стерильного пинцета, и договориться, чтобы они не перекрывались. Будьте осторожны, чтобы не царапать нейрона покрытием поверхности покровного стекла или глии покрытием поверхности блюда.
5. Берут примерно 0,5 мл среды от 6-см блюдо и осторожно смешать с ДНК в трубку, передача ДНК решение вернуться к блюду капать равномерно на поверхности среды.
6. Не вихрем, но аккуратно сдвиньте блюдо туда и обратно в одну сторону, затем остановиться и повторить в перпендикулярном направлении, чтобы равномерно распределить ДНК-Lipofectamine комплексов. Инкубируйте в течение 90 минут в культуре ткани инкубатор (37 ° C, 5% СО _2).
7. Флип покровные ноги стороне вниз, и организовать, чтобы они не перекрывались. Разрешить выражение проводили в течение нужного времени, как правило, в ночь на 48 часов.

Часть 2: Живая съемка GFP с метками плотной основной пузырьки в культуре нейронов гиппокампа

Оборудование установки:

1. Изображений живых клеток требует флуоресцентный микроскоп оснащен ПЗС-камеры, мы используем Leica DMI 6000B инвертированный микроскоп оснащен переменная Leica, люминесцентные лампы. Также необходимо изображения камера с регулятором температуры и цель нагревателя. Мы используем инструменты Warner RC-21BR модифицирован для 18-мм покровным в дополнение к платформе нагреватель (кат. # PH2) и регулятор температуры (кат. # TC324B). Камера содержит никаких открытых портов, модификации, которые могут быть включены при заказе камеры. Цель нагревателя рекомендуется для поддержания температуры покровное и свести к минимуму изменения в центре внимания из-за температурных колебаний. Изображения, полученные с Хамамацу Orca-ER использованием Метаморф (Molecular Devices) программного обеспечения, включая "потокового" способ приобретения дроп-ин. Обратите внимание, мы не используем климатической камере, покрывающий всю микроскопом. Это дополнение является дорогостоящей и не является необходимым для краткосрочных изображений описаны здесь.
2. Другое оборудование и реагенты включают свежеприготовленный живой средой визуализации (1X Хэнкс с Са ^{2 +} и Mg ^{2 +,} 0,6% глюкозы, и 10 мМ HEPES), дополнительный 18-мм покровные стекла, стерильные пинцеты, нестерильные щипцы, Kimwipes, вакуумная смазка , и шприц (без иглы или с модифицированным широким отверстием иглы), с которым применять смазку.

Порядок действий:

1. Подготовка свежей живой средой визуализации (1X Хэнкс с Са ^{2 +} и Mg ^{2 +,} 0,6% глюкозы, и 10 мМ HEPES). Как правило, мы подготовить 50 мл за один раз и хранить при 4 ^° С, когда он не используется. Лучше всего, чтобы подготовить достаточно не более чем на одну неделю времени. Примерно 5-10 мл используются на чашку нейронов.
2. Начало микроскоп, фотоаппарат, люминесцентные лампы, и программное обеспечение получения изображений. Также включения питания камеры платформу и объективной обогреватели.
3. Подготовьте себег камере.
   1. Warner камеры включает вставки тефлон для монтажа покровные. Для удобства манипулирования, этикетку с одной стороны вставить "сверху" с перманентным маркером.
   2. Применить кольцо смазки паз окружающего отверстие в сторону камеры с надписью "сверху". Избегайте использования избыточных как он будет входить в камеру и снижение наблюдаемой области.
   3. Использование щипцов, приложите чистый, неиспользованные 18-см покровное к "верхней" части топки, применить легкое давление на покровное по краям, чтобы создать герметичное уплотнение в канавку встраиваемые камеры.
   4. Включите камеру снова и применить аналогичные кольца смазку на паз на противоположной (нижней) стороны камеры.
   5. Место подготовлена ​​камера дном вверх-на крышке 50-мл трубка, которая является идеальным держателем камеры.
   6. Добавить 750 мкл изображений средней камеры. Это чрезмерное количество, но жира должно препятствовать среды от выплескивания и избыток поможет предотвратить пузыри из оказаться в ловушке, когда клетка покрытая покровное применяется.
   7. Поддерживать подготовлена ​​камера в культуре ткани инкубатора пока нет необходимости. Длительное инкубации, ~ 1 час следует избегать, поскольку изображения среды будет испаряться и изменения в составе.
4. Выполните окончательной сборки камеры и жить изображений клеток.
   1. Перемещение подготовленной камере и блюдо трансфицированных покровные из инкубатора на капот культуры ткани.
   2. Окончательная сборка камеры должны быть выполнены быстро обеспечить клетки остаются погруженными в средних и при 37 ° С непрерывно.
   3. Использование стерильного пинцета, тщательно удалить один из покровного трансфицированных блюдо, касался края покровного стекла, чтобы Kimwipe дабы увлечь ростовой среды.
   4. Место покровное нейрона стороны-вниз на подготовленную камеру. Сенсорный одной стороне покровного стекла на первом и смазки давление по краям, чтобы принести покровное квартиру без захвата пузырьков. Превышение среда визуализации прольется, как ожидалось.
   5. Протрите избыточного среда визуализации, но будьте осторожны, чтобы не скользить покровные вне позиции.
   6. Перемещение камеры в предварительно нагретую платформу нагревателя и закрепить камеру на месте.
   7. Передача камеру на сцену.
   8. Чтобы уменьшить фотообесцвечивания и photoxicity, настроить лампы минимальная сумма интенсивности необходимо найти трансфекции клеток.
   9. Найти ячейку интересов с низким цель нефти увеличением (40х). Это выгодно, чтобы придерживаться запланированных шаблон поиска, чтобы обеспечить максимальный охват покровное и избежать лишних приобретений изображения, например, в левом верхнем углу покровное, сканирование вверх и вниз работает над правом.
   10. Переключение в режим высокой цели нефть увеличением (60-100x) один раз в нужное поле было расположено.
   11. Используйте "поток приобретения" или сравнимые функции обработки изображений программное обеспечение для записи видео флуоресцентно меченных динамики белка.
   12. Возьмите изображение фазы и любые другие сопутствующие изображения (например, растворимый GFP) для последующего анализа и представления данных.
   13. Сохранить все изображения до изучения покровное дальше и записи следующего видео.
   14. Обычно 3-5 видео из одного покровное считается успешным. Фототоксичности и общее состояние здоровья клетка должна иметь в виду, как транспорт снижается в поврежденных клеток. Сотовые здоровья могут контролироваться с помощью наблюдений с использованием фазовых микроскопии. Обычно записи выполняются в течение примерно 30 минут в покровное.

Часть 3: Представитель Результаты:

Живая клетка наблюдения изображения обычно состоят из видео (также известный как "стеками" образов), которые показывают движение флуоресцентно с метками органелл в поле зрения (рис. 1А). Сопровождение каждого видео часто поддержка изображений, которые иллюстрируют ориентации поля зрения по отношению к телу клетки, уровень экспрессии белка и / или здоровью клетки. Видео транспорта могут быть подвергнуты количественному анализу путем преобразования в kymographs (рис. 1В). Kymographs образы, которые иллюстрируют движения частиц, соединив линии сканирования, где каждый момент времени представлена ​​в колонке кимографе. На рисунке 2 показано, как две частицы, движущиеся в противоположном направлении представлены в кимографе. Дальнейший анализ kymographs может предоставить информацию о потоке частиц, скорость, запустить длины, развороты, и стационарных частиц.

Рисунок 1. Представителю живой клетки изображений наблюдений. () Отдельные кадры из видео mCherry с метками тканевого активатора плазминогена (ТПА) транспортом. Индивидуальные частиц, движущихся в антероградной (зеленые стрелки) и ретроградная (красные стрелки) направления указаны. (B) Kymographs иллюстрирующие ТПА-mCherry движения ваксона. Горизонтальные линии в kymographs представляют стационарных объектов, в то время как диагональные линии представляют органелл отходя от (положительный наклон) или в сторону (отрицательный наклон) тела клетки. Длинные зеленые и красные стрелки показывают, работает соответствующая частиц в (А). Изменения на транспорте в связи с микротрубочек depolymerizing реагента, нокодазолом, также может быть проиллюстрирована с кимографе. Обратите внимание на сокращение движущихся органелл на отсутствие диагональных линий.

Discussion

Живая визуализации ячейки сложным, но мощная техника для прямого наблюдения органелл транспорта в культуре нейронов. Трудности могут возникнуть перед процедурой с плохим нейрона здоровья из-за культуры осложнений. Таким образом, клетка здоровье (примеры см. ссылка 4) должны быть оценены до и после трансфекции, наблюдая покровные то время как в среде роста использованием света культуре ткани микроскопом. Процесс передачи нейронных содержащих покровные для камеры изображение может быть стресс на клетки, таким образом, важно проявлять осторожность при манипулировании покровные. Она может быть общей для выглядящий здоровым клеткам не показывают транспорта из-за задержек в процедуре или неполным предварительным нагревом оборудования или уравновешивания визуализации информации. Для транспортировки анализ аксонального и дендритные ориентации должны быть известны, то есть отличительная антероградной и ретроградного транспорта. Поэтому крайне важно, чтобы убедиться, что расположение тела клетки определяется и что непрерывный нейронов сегменте можно увидеть подключения регион представляет интерес для тела клетки. Часто экономия перекрывающихся изображений растворимых GFP, или информационно именования сохранены видео файл, достаточно убедиться процессов ориентации для анализа, например, "Cell1CellBodyUpperLeft".

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine	Reagent	Mediatech, Inc.	10-010-CV
Lipofectamine 2000	Reagent	Invitrogen	11668-027	Transfection reagent
10X Hanks with Ca2+ and Mg2+	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14185-052	Live-imaging medium
1M HEPES	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15630-130	Live-imaging medium