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Biology

Murine Renal Transplantation

doi: 10.3791/1150 Published: July 10, 2009

Summary

Renal Transplantation bei Mäusen ist eine technisch anspruchsvolle Verfahren, dass eine sorgfältige postoperative Betreuung und Behandlung für den Erfolg benötigt.

Abstract

Renal orthotopen Transplantation bei Mäusen ist eine technisch anspruchsvolle Verfahren. Obwohl die erste Nierentransplantation in Mäuse wurden durch Russell et al vor über 30 Jahren (1) durchgeführt und verfeinert von Zhang et al Jahre später (2) haben nur wenige Menschen in der Welt dieses Verfahren beherrschen. In unserem Labor haben wir erfolgreich 1200 orthotopen Nierentransplantation mit> 90% Überlebensrate durchgeführt. Die wichtigsten Punkte für den Erfolg sind strengere Kontrolle der Reperfusion, Blutungen und Thrombosen, sowohl während des Verfahrens und nach der Transplantation und die Verwendung von 10-0 anstelle von 11-0 Naht für Anastomosen.

Post-operative Behandlung und Pflege des Empfängers ist extrem wichtig für den Erfolg und Einschätzung für eine Transplantation. Alle Nierentransplantats Empfänger erhalten Antibiotika in Form einer Injektion von Penicillin sofort nach der Transplantation und sulfatrim in das Trinkwasser ständig. Insgesamt Tiergesundheit ausgewertet wird täglich und Vollblut-Kreatinin-Analysen werden regelmäßig mit einem tragbaren I-STAT Maschine Organfunktion zu beurteilen durchgeführt.

Protocol

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Spenderorgan Ernte (2):

  1. Anesthetize des Spenders mit 65mg/kg Pentobarbital IP; Anästhesie wird durch Isofluran (2-3%) erhalten.
  2. Machen Sie einen Medianschnitt vom Brustbein bis zum Schambein zum Spender Bauch geben und setzen die linke Niere, indem der Darm seitlich an der rechten Seite.
  3. Isolieren Sie die linke Niere durch Unterbindung und Teilen der Nebennieren und Hoden-Schiffe mit einer 8-0 Seidenfaden.
  4. Mobilisieren der Aorta oberhalb seiner Einmündung in die A. und V. renalis.
  5. Mobilisieren Sie die untere Hohlvene (IVC) oberhalb und unterhalb der Kreuzung mit der renalen Arterie und Vene.
  6. Ligieren der Aorta unterhalb der Nieren-Arterie und Vene mit einer 8-0 Seidenfaden, um Blutungen zu minimieren.
  7. Präparieren Sie die linke Ureter aus dem Nierenhilus in die Blase.
  8. Setzen Sie die ureterovesical Kreuzung mit kaudaler Einfahren auf die Blase Kuppel.
  9. Excise eine kleine, elliptische Patch der Blase mit der linken ureterovesical Kreuzung für Harn-Rekonstruktion über eine Blase zu Blase Anastomose verwendet. Der rechte Ureter ist nicht mit der Blase enthalten.
  10. Ligieren des IVC unterhalb der Nieren-Arterie und Vene mit einer 8-0 Seidenfaden.
  11. Ligieren der Aorta oberhalb der Nierenarterie und Vene, und langsam perfuse das Transplantat in situ mit 0,2-0.4ml Kälte, heparinisierten Ringer-Laktat-Lösung über das infrarenalen Aorta.
  12. Ligieren des IVC oberhalb der A. und V. renalis mit einem 8-0 Seidenfaden.
  13. Transect der Nierenvene bei ihrem Zusammentreffen mit der IVC.
  14. Teilen Sie die Aorta schräg, etwa 2mm unterhalb der Nierenarterie.
  15. Entfernen der Niere und ihrer Gefäßversorgung mit Harnleiter an die Blase Patch en bloc. Shop in Lactat-Lösung Ringer auf dem Eis.
  16. Euthanize des Spenders Maus durch Genickbruch unter Narkose.

Empfänger Transplantation (2):

  1. Anesthetize der Empfänger mit 65 mg / kg Pentobarbital IP und Aufrechterhaltung der Narkose durch Isofluran (2-3%).
  2. Machen Sie eine Mittellinienschnitt decken den Darm mit nassen Gaze und vorsichtig zieht es zur linken Seite.
  3. Ligieren des rechten Ureters, Nieren-Arterie und Vene, und entfernen Sie die rechte Niere.
  4. Sorgfältig zu isolieren und cross-clamp der infrarenalen Aorta und IVC mit zwei 4-mm microvasular Schellen nach Ligation der Lendenwirbelsäule Filialen.
  5. Legen Sie eine 10-0 Nylonfaden durch eine vollständige Dicke der Aorta und zurückziehen, um eine elliptische aortaotomy durch einen einzigen Schnitt (etwa ein Fünftel des Durchmessers des Schiffes) zu machen.
  6. Machen Sie eine longitudinale Venotomie durch Einstechen in die IVC mit einer 30-Gauge-Nadel und erweitern entsprechend mit Mikroschere.
  7. Spülen sowohl die Aorta und IVC mit heparinisierten Kochsalzlösung auf intraluminale Blut oder Blutgerinnsel klar.
  8. Entfernen Sie die Spenderniere aus dem Eis und legen Sie sie intraabdominell in die rechte Flanke der Maus. Die Spenderniere wird feucht gehalten mit einem kalten Kochsalzlösung getränkten Gaze-Pad.
  9. Legen Sie zwei Haltefäden am proximalen und distalen Spitze der Empfänger aortaotomy mit den Gebern Aorten-Manschette.
  10. Machen Sie eine Ende-zu-Seit-Anastomose zwischen Spender Aorten-Manschette und die vordere Wand der Empfänger aortaotomy, mit 2 bis 3 kontinuierlich 10-0 Nylon Nähte in der Außenseite der Aorta.
  11. Schalten Sie die Spenderniere Transplantat an der linken Flanke des Empfängers. Wiederholen Sie den vorherigen Verfahren zwischen den Donor-Aorten-Manschette und der hinteren Wand der Empfänger aortaotomy
  12. Führen Sie eine Ende-zu-Seit-Anastomose zwischen Spender Nierenvene und die hintere Wand der Empfänger IVC, mit 4 bis 5 kontinuierlich 10-0 Nylon Nähte in der Innenseite des IVC. und dann die vordere Wand der IVC und Spendern Nierenvene mit 4 ~ 5 kontinuierliche Nähte außerhalb des IVC geschlossen.
  13. Die Anastomose der beiden Vene und Arterie müssen innerhalb von 20 Minuten abgeschlossen sein.
  14. Spülen Sie das Transplantat mit kalter Kochsalzlösung mehrmals Anastomose.
  15. Teilen Sie die Kuppel des Empfängers Blase und Blutungen stoppen mit Kauter.
  16. Machen Sie einen kleinen Schnitt an der Kuppel.
  17. Legen Sie zwei Haltefäden von 10-0 Nylon an die Spender kleine Blase Patch mit den Empfängern Blase Kuppel anastomize. Jede Seite der Anastomose wird mit 8 ~ 10 ständige Stiche genäht.
  18. Schließen Sie den Bauch in zwei Schichten mit kontinuierlicher 4-0 sterile, synthetischen resorbierbaren Vicryl Naht.
  19. Geben Empfängermäuse 0.4ml warmen Kochsalzlösung während der Operation durch intermittierende Injektion IV.

Post-operative Betreuung der Empfänger

  1. Nach dem Schließen der Bauch, ist eine einmalige intramuskuläre Injektion von Penicillin (500U/10g) verabreicht (2).
  2. Darüber hinaus erhalten die Empfänger 0,05 mg / kg Buprenorphin intramuskulär am Tag 0 und Tag 1 nach der Operation zur Schmerzlinderung. Nach der Operation erhalten Transplantationspatienten Wasser mit sulfatrim (100mg/kg), bis das Experiment terminated.
  3. Für die ersten 24 Stunden postoperativ Mäuse sind in einem temperierten Brutschrank gehalten.
  4. Mäuse in der Regel aus der Narkose innerhalb von 1 Stunde der Operation erholen und erhalten regelmäßig Futter und Wasser ad libitum.
  5. Hautnähte sind 2 Wochen nach der Operation entfernt.

Empfänger Nephrektomie

  1. Anesthetize der Empfänger 4 ~ 7 Tage nach einer Nierentransplantation mit 65 mg / kg Pentobarbital IP; Anästhesie wird durch Isofluran (2-3%) erhalten.
  2. Öffnen Sie den Bauch über eine Inzision in der Mittellinie.
  3. Bedecken Sie den Darm mit Kochsalzlösung getränkten Gaze und vorsichtig zieht es zur rechten Seite.
  4. Entfernen Sie die linke Niere nach Unterbindung der linken Harnleiter-, Nieren-Vene und Arterie.
  5. Schließen Sie den Bauch in zwei Schichten mit kontinuierlicher 4-0 synthetischen resorbierbaren Vicryl Naht.

Vollblut Kreatinin-Messungen

  1. -Bis zweiwöchigen Blutentnahme von weniger als 0,2 cc ist entweder submandibularly ohne Narkose oder retroorbital unter Isofluran-Narkose durchgeführt.
  2. Quantitative ganze Blutkreatininspiegel werden mit Hilfe eines I-Stat Tragbare Clinical Analyzer (Heska Corp, Fort Collins, CO).
  3. Konventionelle Einheiten (mg / dl) sind in SI-Einheiten von Mikromol / L durch Multiplikation des herkömmlichen Geräten um 88,4 umgewandelt.

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Discussion

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Wir haben rund 1200 Fälle von Nierentransplantation bei Mäusen mit einer technischen Erfolgsrate von> 90% durchgeführt. Im Vergleich zur Herztransplantation ist die Erfolgsrate von Nierentransplantationen in der Regel gering. Allerdings hat unser Labor eine hohe Erfolgsrate (> 90%) von Nieren-Transplantation erhalten. Die wichtigsten Punkte für den Erfolg sind bis zur Reperfusion Verletzungen an beiden Spenderniere und Empfänger zu reduzieren und zu minimieren Blutungen und Thrombosen während des gesamten Verfahrens und nach der Operation. Die folgenden Faktoren können die wichtigsten: (a) zu reduzieren Blutungen in den Empfänger während der Operation so viel wie möglich durch sorgfältige und schonende Betrieb, (b) zu minimieren warmen Ischämie und Cross-Klemm-Zeiten während Spenderniere Vorbereitung und Empfänger der Transplantation; (c) mit einem kleinen Spender Blase Patch zur Nekrose, eine unzureichende Blutversorgung und Harnabgang nach der Operation zu verhindern; (d) Verzögerung Nephrektomie der nativen Nieren bis 4 ~ 7 Tage nach der Transplantation, damit der transplantierten Niere die Funktion nach der Operation zu erholen; (e ) durchführen Anastomosen (zwischen Spender Aorta Manschette und die vordere Wand und zwischen den Donor-Aorten-Manschette und der hinteren Wand des Empfängers Aorta), die außerhalb der Aorta, die Häufigkeit von Thrombosen zu verringern; (f) zu halten Empfängermäuse warm zumindest für 24 Stunden nach der Operation; (g) geben Antibiotika Empfängermäuse postoperativ mögliche Infektionen zu verhindern.

In diesem Protokoll haben wir 10-0 anstelle von 11-0 Naht ohne Beeinträchtigung der Überlebensrate. Obwohl die 11-0 Naht ist ideal und wird in vielen Labors der Transplantation, fühlen wir, dass 10-0 Naht ausreichend für den Einsatz in Nierentransplantation ist, solange die oben beschriebenen Faktoren gut kontrolliert sind.

Die Entfernung der verbliebenen einheimischen Niere ist wichtig, damit Abnahme der Nierenfunktion die Organfunktion von Serum-Kreatinin-Messungen überwacht werden kann. Alle Nieren-Transplantat-Empfänger unterziehen Nephrektomie der linken Niere nativen zwischen 4 und 7 Tage nach der Nierentransplantation. Nephrektomie ist nicht zum Zeitpunkt der Nierentransplantation durchgeführt, weil die Empfänger charakteristisch Krankheit leiden oder nicht überleben, wenn beide Verfahren gleichzeitig durchgeführt werden. A 4 bis 7 Tage Verzögerung zwischen Verfahren erlaubt die Niere Graft von Ischämie und Reperfusion erholen, bevor die native Niere entfernt wird. Kidney Transplantat-Funktion wird durch tägliche Untersuchung des gesamten Tiergesundheit und Blutkreatininspiegel beurteilt. Als Referenz hat eine nicht-transplantierte, normale Maus einer Kreatinin-Niveau von etwa 20 Mikromol / L. Renal Allotransplantatabstoßung wird vermutet, wenn der Empfänger der Maus Anzeichen der Krankheit zeigt und die Kreatinin-Werte sind in der Nähe 100 Mikromol / L, zu welchem ​​Zeitpunkt Transplantate sind für eine histopathologische Analysen geerntet erhöht.

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Disclosures

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der Ohio State University IACUC gesetzt durchgeführt.

Acknowledgments

Diese Studien wurden zum Teil finanziert durch den NIH R01 AI36532 zu GAH unterstützt. Wir möchten die hervorragende Unterstützung in der Transplantationsmedizin Pathologie von Dr. Tibor Nadasdy vorgesehen anerkennen, und die wertvolle Anleitung und Weitsicht von dem verstorbenen Dr. Charles G. Orosz bei der Initiierung dieser Forschungsanstrengungen zur Verfügung gestellt.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
i-STAT Other HESKA Cat 5101
i-STAT Cartridge Other HESKA CAT 5110-CREA
Sulfatrim Other Actavis R02109
Isoflurane Other NOVAPLUS CA-0474
10-0 Suture Surgery Sharpoint AK0100

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References

  1. Russell, P. S., Chase, C. M., Colvin, R. B., Plate, J. M. D. Kidney transplants in mice. An analysis of the immune status of mice bearing long-term, H-2 incompatible transplants. JExpMed. 147, 1449-1468 (1978).
  2. Zhang, Z., Schlachta, C., Duff, J., Stiller, C., Grant, D., Zhong, R. Improved techniques for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 16, (2), 103-109 (1995).
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Cite this Article

Wang, J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A. Murine Renal Transplantation Procedure. J. Vis. Exp. (29), e1150, doi:10.3791/1150 (2009).More

Wang, J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A. Murine Renal Transplantation Procedure. J. Vis. Exp. (29), e1150, doi:10.3791/1150 (2009).

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