Procedimiento murino Trasplante Renal

Summary

El trasplante renal en ratones es un procedimiento técnicamente difícil que requiere una cuidadosa atención post-operatoria y el tratamiento para el éxito.

Abstract

El trasplante renal ortotópico en ratones es un procedimiento técnicamente difícil. Aunque los trasplantes de riñón por primera vez en los ratones fueron realizados por Russell et al más de 30 años (1) y refinado por Zhang et al año más tarde (2), muy pocas personas en el mundo han llegado a dominar este procedimiento. En nuestro laboratorio se han realizado con éxito trasplantes de riñón ortotópico de 1200 con una tasa de> supervivencia del 90%. Los puntos clave para el éxito incluyen un estricto control de la reperfusión, hemorragia y trombosis, tanto durante el procedimiento y después del trasplante, y el uso de 10-0 en lugar de 11-0 sutura de la anastomosis.

Cuidados post-operatorios y tratamiento del receptor es extremadamente importante para el éxito del trasplante y la evaluación. Todos los receptores de injerto renal recibir antibióticos en forma de una inyección de penicilina inmediatamente después del trasplante y Sulfatrim en el agua potable continuamente. Salud de los animales en general se evalúa a diario y todo análisis de creatinina en la sangre se llevan a cabo habitualmente con un portátil I-STAT máquina para evaluar la función del injerto.

Protocol

Donantes de órganos de cosecha (2):

1. Anestesiar a los donantes con IP 65mg/kg pentobarbital, la anestesia se mantiene por isoflurano (2.3%).
2. Haga una incisión desde el esternón hasta el pubis para entrar en el abdomen de los donantes y exponer el riñón izquierdo, moviendo el intestino lateralmente hacia el lado derecho.
3. Aislar el riñón izquierdo por ligar y dividir los vasos suprarrenales y los testículos con una sutura de seda 8-0.
4. Movilizar a la aorta por encima de su unión con la arteria y la vena renal.
5. Movilizar a la vena cava inferior (VCI) por encima y por debajo de su unión con la arteria y la vena renal.
6. Ligar la aorta por debajo de la arteria y vena renal con una sutura de seda 8-0 para minimizar el sangrado.
7. Disecar el uréter izquierdo desde el hilio renal hasta la vejiga.
8. Exponer la unión ureterovesical con retracción caudal en el domo de la vejiga.
9. Los impuestos especiales un pequeño parche, elíptica de la vejiga que contiene la unión ureterovesical izquierda, que se utiliza para la reconstrucción urinaria a través de una anastomosis de la vejiga de la vejiga. El uréter derecho no está incluido en la vejiga.
10. Ligar la vena cava inferior por debajo de la arteria y vena renal con una sutura de seda 8-0.
11. Ligar la aorta por encima de la arteria y vena renal, y poco a poco perfusión del injerto in situ con 0,4 ml de 0,2 frío, heparinizada solución de Ringer lactato a través de la aorta infrarrenal.
12. Ligar la vena cava inferior por encima de la arteria y vena renal con una sutura de seda 8-0.
13. Transecto de la vena renal en su unión con la vena cava inferior.
14. Divide la aorta oblicuamente, de aproximadamente 2 mm por debajo de la arteria renal.
15. Extraer el riñón y su aporte vascular con uréter unido a la revisión de la vejiga en bloque. Tienda en solución de Ringer lactato en el hielo.
16. La eutanasia de los donantes del ratón por dislocación cervical bajo anestesia.

Receptor Trasplante (2):

1. Anestesiar al destinatario con 65 mg / kg de pentobarbital IP y mantener la anestesia por isoflurano (2.3%).
2. Hacer una incisión, la cubierta del intestino con una gasa húmeda y con cuidado retirar a la izquierda.
3. Ligar el uréter derecho, la arteria y la vena renal, y quitar el riñón derecho.
4. Con cuidado, aislar y cruz de pinza de la aorta infrarrenal y vena cava inferior con dos pinzas de 4 mm microvasular después de la ligadura de las ramas lumbar.
5. Colocar una sutura de nylon 10-0 a través de un espesor total de la aorta y se retraen de hacer una aortaotomy elíptica de un solo corte (aproximadamente una quinta parte del diámetro del vaso).
6. Hacer una venotomía longitudinal por la perforación de la vena cava inferior con una aguja de calibre 30 y se extienden adecuadamente utilizando micro tijeras.
7. Riego de la aorta y vena cava inferior con solución salina heparinizada para limpiar la sangre intraluminal o coágulos.
8. Extirpar el riñón de donantes del hielo y colocarlo dentro del abdomen en el costado derecho del ratón. El riñón del donante se mantiene húmedo con una gasa empapada en solución salina fría.
9. Coloque dos suturas en el vértice proximal y distal de la aortaotomy los beneficiarios con el manguito de los donantes de aorta.
10. Hacer una anastomosis término-lateral entre el manguito aórtica donantes y la pared anterior de la aortaotomy destinatarios, con 2 o 3 continua 10-0 de nylon en el exterior de la aorta.
11. A su vez el injerto renal de donante a la banda izquierda del destinatario. repita el procedimiento anterior entre el manguito de la aorta de los donantes y la pared posterior de la aortaotomy destinatarios
12. Realizar una anastomosis término-lateral entre la vena renal de donante y la pared posterior de la VCI destinatarios, con 4 a 5 continua 10-0 de nylon en el interior de la vena cava inferior. y luego la pared anterior de la vena renal IVC y los donantes se cierran con 4 ~ 5 puntos de sutura continua fuera de la vena cava inferior.
13. La anastomosis de la vena y la arteria tanto debe ser terminado en 20 minutos.
14. Enjuague el injerto con solución salina fría veces varias durante la anastomosis.
15. Divide la cúpula de la vejiga receptor, y detener la hemorragia con cauterización.
16. Haz un pequeño corte en la cúpula.
17. Coloque dos suturas de nylon 10-0 para anastomize el parche donantes vejiga pequeña con la cúpula de la vejiga destinatarios. Cada lado de la anastomosis se sutura con 8 ~ 10 puntos de sutura continua.
18. Cerrar el abdomen en dos capas con continuas 4-0 estéril, sintético absorbible Vicryl.
19. Dar a los ratones receptores 0,4 ml de solución salina caliente durante la operación de inyección IV intermitente.

Cuidados post-operatorios del destinatario

1. Después de cerrar el abdomen, una sola inyección intramuscular de penicilina (500U/10g) se administra (2).
2. Además, los beneficiarios reciben 0,05 mg / kg por vía intramuscular la buprenorfina en el día 0 y 1 día después de la cirugía para el dolor. Después de la cirugía, los receptores de trasplante recibir el agua que contiene Sulfatrim (100mg/kg) hasta que el experimento se terminated.
3. Para las primeras 24 horas después de la operación los ratones se mantienen en una incubadora con temperatura controlada.
4. Los ratones se recuperan de la anestesia antes de 1 hora de la operación y se les da la comida regular y agua ad libitum.
5. Suturas de la piel se retiró 2 semanas después de la cirugía.

Receptor nefrectomía

1. Anestesiar el receptor 4 ~ 7 días después del trasplante renal con 65 mg / kg IP pentobarbital, la anestesia se mantiene con isoflurano (2.3%).
2. Abra el abdomen mediante una incisión de línea media.
3. Cubrir el intestino con una gasa empapada en solución salina y con cuidado retirar a la derecha.
4. Extirpar el riñón izquierdo después de la ligadura de la vena del uréter izquierdo, el riñón y la arteria.
5. Cerrar el abdomen en dos capas con continuas 4-0 sintético absorbible Vicryl.

Las mediciones de creatinina en sangre entera

1. Semanales para la extracción de sangre cada dos semanas de menos de 0,2 cc se lleva a cabo ya sea submandibularly sin anestesia o retro orbital, bajo anestesia con isoflurano.
2. Cuantitativa los niveles de creatinina en la sangre entera se determinó utilizando un analizador de i-STAT Portable Clínica (Heska Corp., Fort Collins, CO).
3. Unidades convencionales (mg / dl) se convierten a las unidades de mol / L, multiplicando las unidades convencionales de 88,4.

Discussion

Hemos llevado a cabo aproximadamente 1200 casos de trasplante renal en ratones con una tasa de éxito técnico de> 90%. En comparación con el trasplante de corazón, la tasa de éxito del trasplante renal es generalmente baja. Sin embargo, nuestro laboratorio ha mantenido una alta tasa de éxito (> 90%) de un trasplante de riñón. Los puntos clave para el éxito son la reducción de las lesiones de reperfusión en los riñones de donantes y receptores de ambos, y minimizar la hemorragia y trombosis durante todo el procedimiento y después de la intervención. Los siguientes factores pueden ser más importantes: (a) reducir el sangrado en el recipiente durante la operación tanto como sea posible a través de una cuidadosa operación y suave, (b) reducir al mínimo los tiempos de isquemia caliente y la cruz de sujeción durante la preparación de riñón de donante y el receptor del trasplante, (c) usar un parche de donantes vejiga pequeña para evitar la necrosis, suministro insuficiente de sangre y las fugas de la vejiga después de la operación, (d) retraso de la nefrectomía del riñón nativo hasta 4 ~ 7 días después del trasplante para permitir que el riñón trasplantado para recuperar la función después de la cirugía; (e ) realizar las anastomosis (entre el manguito de la aorta de los donantes y la pared anterior y entre el manguito de la aorta de los donantes y la pared posterior de la aorta del receptor) fuera de la aorta para reducir la incidencia de trombosis; (f) mantener los ratones receptores de abrigo para por lo menos para 24 horas después de la cirugía; (g) dar antibióticos a los ratones receptores después de la cirugía para prevenir posibles infecciones.

En este protocolo, se utiliza en lugar de 10-0 11-0 sutura sin afectar la tasa de supervivencia. A pesar de la sutura 11-0 es ideal y utilizado en muchos laboratorios de trasplante, nos parece que 10-0 sutura es suficiente para su uso en el trasplante renal, siempre y cuando los factores descritos anteriormente están bien controlados.

La extirpación del riñón nativo restante es esencial para que el declive en la función del injerto renal puede ser monitoreada por mediciones de creatinina sérica. Todos los receptores de injerto renal se someten nefrectomía del riñón izquierdo nativo de entre 4 y 7 días después del trasplante renal. Nefrectomía no se realiza en el momento del trasplante de riñón debido a los destinatarios característicamente sufren de mala salud o no sobreviven cuando ambos procedimientos se llevan a cabo al mismo tiempo. Un retraso de 4-7 días entre un procedimiento y permite que el injerto renal para recuperarse de la lesión por isquemia y reperfusión antes de que el riñón nativo es eliminado. La función del injerto renal se evalúa con exámenes diarios de la sanidad animal en general y los niveles de creatinina en la sangre. Como referencia, un no trasplantados, el ratón normal tiene un nivel de creatinina de 20 micromoles / l. Rechazo del injerto renal se sospecha cuando el ratón receptor muestra signos de enfermedad y el nivel de creatinina se elevan cerca de 100 micromoles / L en la que los injertos de tiempo se recogen para análisis histopatológico.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
i-STAT	Other	HESKA	Cat 5101
i-STAT Cartridge	Other	HESKA	CAT 5110-CREA
Sulfatrim	Other	Actavis	R02109
Isoflurane	Other	NOVAPLUS	CA-0474
10-0 Suture	Surgery	Sharpoint	AK0100