Het visualiseren van de Live- Drosophila Gliale-neuromusculaire Junction met fluorescente kleurstoffen
Summary
We structurele kenmerken van de Glia-neuromusculaire synapsen beschreven in een roman Inside-out het prepareren van weefsels van levende larven gebruik van fluorescerende kleurstoffen met confocale microscopie. We leven zenuwuiteinden gelabeld met fluorescente primaire antilichamen tegen HRP, en ook gevisualiseerd het perisynaptic ruimte met fluorescerende dextranen.
Abstract
Ons project geïdentificeerd GFP-gelabelde gliale structuren op de zich ontwikkelende larven vliegen neuromusculaire synaps. Om te kijken naar de ontwikkeling van levende gliale-zenuw-spier synapsen, ontwikkelden we een schaal voor het prepareren van weefsels die kenmerken van levende larven intact was, maar had ook een goede optische eigenschappen. Deze nieuwe preparaat ook toegestaan voor toegang van perfusates aan de synaps. We gebruikten vliegen larven, ondergedompeld ze in kunstmatige hemolymfe, en hun normale ritmische samentrekkingen lichaam ontspannen door koeling hen. Vervolgens hebben we ontleed uit de achterste segmenten van elk dier en met een stomp insect pin duwde de monddelen achteruit door de lichaamsholte. Dit eversie het larvale lichaam muur, zoals het draaien van een sok binnenstebuiten. We hebben de dissectie met ultra-fijne dissectie schaar en dus blootgesteld de viscerale zijkant van het lichaam muur spieren. De gliale structuren op het NMJ uitgedrukt membraan gericht GFP onder de controle van gliale specifieke promotors. De post-synaptische membraan, de SSR (Subsynaptic Reticula) in de spieren uitgedrukt synaptisch gerichte DsRed. We moesten acuut label van de motor neuron terminals, het derde deel van de synaps. Om dit te doen we primaire antilichamen toegepast op de HRP, geconjugeerd aan een ver-rood emitterende flurophore. Om te testen op kleurstofdiffusie eigenschappen in de perisynaptic ruimte tussen de motor neuron terminals en de SSR, passen we een oplossing van grote Dextraan moleculen geconjugeerd met ver-rood emitterende flurophore en verzamelde beelden.
Protocol
Discussion
Deze procedure maakt op lange termijn in beeld brengen van live-gelabelde eiwitten en celprocessen. De in situ weefsel prep we beschreven heeft een intact en het functioneren CNS, PNS en reflex circuits. Dit weefsel prep heeft voordelen ten opzichte van standaard larvale vliegen spier-protocollen, waar de larven lichaam muur spier wordt uitgerekt (wanneer het wordt gespeld out). Stretching kan vervormen synaptische morfologie en trigger reflex op basis van de weeën. Onze binnen en van buiten prep was mechanisc…
Acknowledgements
Dit project werd gefinancierd door de CIHR en NSERC. We willen graag Barb Jusiak erkennen om bij te dragen tot de oprichting van de vlieg stammen uiten DsRed label SSR (BJ lijn), en de UBC Bio-imaging Facility.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| HL-6: Artifical Drosophila hemolymph, with 5 mM L-glutamate added, and 2 mM Calcium. | Reagent | NA | NA | 5 mM L-glutamate blocked muscle contractions. We used Molecular grade L-Glutamate (Sigma). 2 mM Calcium is close to physiological Calcium levels in natural larval hemolymph. References: Macleod et al 2002 and Macleod 2004 |
| Dextran, Alex Fluor 680; 10,000 MW, anionic, fixable | Reagent | Molecular Probes/Invitrogen | D34680 | Use a small volume perfusion chamber to keep the total volume of dye low |
| Anti-HRP-CY5 conjugate (goat) | Reagent | Jackson ImmunoResearc | 123-175-021 | Dilute 2.0 mg into 1 ml ddH2O; aliquot into 4 microliter aliquots. Freeze at –20C. Dilute one aliquot into 100 microliters of HL-6 |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Reagent | Molecular Probes/Invitrogen | A10475 | We prepared a total of 80 micro liters of conjugated primary antibody, and stored as 2 microliter aliquots. We diluted each aliquot into 100 microliter of HL-6 for labeling. |
| Custom Formulated Objective Oil, refractive index 1.3379 | Reagent | Cargill Labs | Custom Formulated | |
| Ultra Fine Forceps | Tool | Fine Science Tolls | 11252-23 or 11295-20 | |
| Spring scissors | Tool | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Ultra fine clipper scissors | Tool | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Perfusion Chamber RC 20 Series | Tool | Warner Instruments | 64-02222 | |
| Spinning Disc confocal | Microscope | Quorum | Quorum Wave FX | Mounted on a Leica DMI6000 Inverted Microscope |
References
- Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M., Atwood, H. L. Synaptic Vesicles: Test for a role in presynaptic Calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
- Macleod, G. T., Hegstro, M., Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast Calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiology. 88, 2659-2663 (2002).
- Morales, M., Ferrus, A., Martinez-Padron, M. Presynaptic calcium-channel currents in normal and csp mutant Drosophila peptidergic terminals. Eur J Neurosci. 11, 1818-1826 (1999).
- Stork, T., Engelen, D., Krudewig, A., Silies, M., Bainton, R. J., Kla¨mbt, C. Organization and Function of the Blood–Brain Barrier in Drosophila. J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).
