Visualisierung der Live- Drosophila Glial-neuromuskulären Synapse mit Fluoreszenzfarbstoffen

Zusammenfassung

Wir beschriebenen strukturellen Merkmale der Glia-neuromuskuläre Synapsen in einem Roman Inside-out Gewebe Vorbereitung der Live-Larven unter Verwendung von fluoreszierenden Farbstoffen mit der konfokalen Mikroskopie. Wir gekennzeichnet leben Neuronenendigungen mit fluoreszierenden primären Antikörper gegen HRP und auch visualisiert die perisynaptic Raum mit fluoreszierenden Dextrane.

Zusammenfassung

Unser Projekt identifiziert GFP-markierten Gliazellen Strukturen an der Entwicklung von Larven zu fliegen neuromuskulären Synapse. Um sich die Entwicklung von Live-Glia-Nerv-Muskel-Synapsen, entwickelten wir eine Larvengewebe Vorbereitung, die Features von Live intakten Larven hatte, sondern hatte auch gute optische Eigenschaften. Das neue Präparat auch für den Zugang von Perfusaten zur Synapse erlaubt. Wir verwendeten Fliegenlarven, eingetaucht in diese künstliche Hämolymphe, und entspannt ihre normale rhythmische Kontraktionen Körper durch Kälte ihnen. Als nächstes werden wir aus der hinteren Segmente der einzelnen Tiere seziert und mit einem stumpfen Insekten pin schob die Mundwerkzeuge rückwärts durch die Leibeshöhle. Diese umgestülpt die Larven Körper Wand, wie aus einer Socke von innen nach außen. Wir haben die Dissektion mit ultra-feinen Sezierung Schere und somit ausgesetzt der viszeralen Seite des Körpers Wand Muskeln. Die Glia-Strukturen an der NMJ ausgedrückt Membran gezielt GFP unter der Kontrolle von Glia-spezifische Promotoren. Die postsynaptischen Membran, die SSR (subsynaptischen Reticula) im Muskel ausgedrückt synaptisch gezielte dsRed. Wir mussten akut Etikett der Motor Neuron-Terminals, der dritte Teil der Synapse. Dazu wandten wir primäre Antikörper gegen HRP, konjugiert mit einem weit rot emittierenden Fluorophor. Zur Prüfung auf Farbstoffdiffusion Eigenschaften in die perisynaptic Raum zwischen den Motoneuronen-Terminals und der SSR, verwendeten wir eine Lösung der großen Dextran-Moleküle konjugiert weit rot emittierenden Fluorophor und sammelte Bilder.

Protokoll

Teil 1: Tissue Vorbereitung

1. Unser Ziel ist ein Gewebe Vorbereitung von Fliegenlarven, wo das Nervensystem intakt ist, aber die innere Oberfläche des Körpers Wand Muskel ist, um eine künstliche Hämolymphe ausgesetzt sind, und schließen kann, ein Mikroskop Deckglas für eine gute Optik positioniert werden. In anderen Worten, eine von innen nach außen Larven Vorbereitung.
   
   Da herkömmliche Gewebe Vorbereitungen Schneiden, Pinning und Dehnen des Körpers Wand Muskeln, und manchmal Entfernen eines Teils des Nervensystems beteiligt, mussten wir einen anderen Ansatz.
   
   Wir wollten die Tiere von innen nach außen, weil wir einen guten Blick auf ....

Diskussion

Dieses Verfahren ermöglicht langfristige Darstellung von Live-markierten Proteine ​​und zelluläre Prozesse. Die in situ Tissue prep beschrieben wir eine intakte und funktionierende ZNS, PNS und Reflex-Schaltungen. Dieses Gewebe prep hat Vorteile gegenüber Standard-Larven fliegen Muskel-Protokolle, in denen die Larven Körperwand Muskel gedehnt (wenn es merken wird). Stretching kann verzerren synaptischen Morphologie und Trigger-Reflex basiert Kontraktionen. Unsere in-und auswendig prep war mechanisch stabil und .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
HL-6: Künstliche Drosophila-Hämolymphe mit 5 mM L-Glutamat und 2 mM Calcium	Reagenz	N/V	NA	5 mM L-Glutamat blockierte Muskelkontraktionen. Wir verwendeten molekularbiologisches L-Glutamat der Firma Sigma. 2 mM Calcium liegt nahe an den physiologischen Calciumspiegeln in natürlicher larvaler Hämolymphe. Referenzen: Macleod et al. 2002 und Macleod 2004
Dextran, Alex Fluor 680; 10.000 MW, anionisch, fixierbar	Reagenz	Molecular Probes, Life Technologies	D34680	Verwenden Sie eine kleine Perfusionskammer, um das Gesamtvolumen des Farbstoffs gering zu halten
Anti-HRP-CY5-Konjugat (Ziege)	Reagenz	Jackson ImmunoResearch	123-175-021	2,0 mg in 1 ml ddH2O verdünnen; in Aliquots zu je 4 Mikroliter portionieren. Bei –20 °C einfrieren. Ein Aliquot in 100 Mikroliter HL-6 verdünnen
Alexa 647 Antikörper-Markierungs-Kit	Reagenz	Molecular Probes, Life Technologies	A10475	Wir stellten insgesamt 80 Mikroliter konjugierten Primärantikörper her und lagerten ihn in Aliquots zu je 2 Mikroliter. Jedes Aliquot wurde zur Markierung in 100 Mikroliter HL-6 verdünnt
Speziell formulierte Objektivöl, Brechungsindex 1,3379	Reagenz	Cargill Labs	Speziell formuliert
Ultrafeine Pinzette	Werkzeug	Fine Science Tools	11252-23 oder 11295-20
Federschere	Werkzeug	Fine Science Tools	91500-09
Ultrafeine Schneideschere	Werkzeug	Fine Science Tools	15200-00
Perfusionskammer RC-20-Serie	Werkzeug	Warner Instruments	64-02222
Spinning-Disk-Konfokalmikroskop	Mikroskop	Quorum Technologies	Quorum Wave FX	Auf einem umgekehrten Leica-DMI6000-Mikroskop montiert