Сотовые приготовления: До посева ячейки для анализа, культуру нейронов / астроциты в питательной среде до ~ 70-80% сливной (если ячейка посева непосредственно от оттепели или изоляции). Отсоедините клетки от культуры колбы / пластин через метод, соответствующий типу клеток, представляющих интерес. Если необходимо, пальто анализа пластины скважин с поли-D-лизина или внеклеточного матрикса белка для повышения адгезии клеток. Сотрудничество культур астроцитов и нейронов могут быть посеяны одновременно или последовательно. Для последовательного рассада, покрытие астроцитов сначала как "базальных" слой рекомендуется, а затем нейронов покрытия и дифференциации, если это необходимо. Отрегулируйте плотность клеток в зависимости типа клеток, последующее время культура, параметры проценты и т.д. В зависимости от культуры возрасте, источником клеток и плотности посева, первичных культур могут значительно различаться по скорости распространения, GFAP выражение или аксонов – это важно характеризуют и оптимизировать клеточной системы, чтобы обеспечить наиболее биологической значимости для вашей экспериментальной модели, а также для обеспечения эффективной обработки изображений, сегментации и анализа с использованием ЖКХ (см. Рисунок 1). После добавления клетки пластины (клетки могут быть посеяны в 90 мкл средства массовой информации, чтобы облегчить токсина лечение, как описано в шаге 3 ниже), позволяют пластины, чтобы сидеть на ровной поверхности при комнатной температуре в течение 15-30 мин, что позволяет даже распределения клеток. После этого периода инкубации клеток в питательной среде (37 ° C / 5% CO 2), по крайней мере 24 часов, затем переключиться в условиях дифференциации культуры (например, низкая сыворотки / NGF для PC12 клетки), в случае необходимости. Продолжить культуры до клетки достигают желаемого уровня слияния или дифференциации, изменение средств массовой информации с интервалом подходит для типа клеток. Сотовые лечения (контроль соединений, проверить соединения и т.д.) могут быть введены в любой момент в течение этого периода культивирования, в случае необходимости на время курса лечения, представляющих интерес. Акриламид, перекись водорода и К-252 поставляются как нейротоксическое соединений контроля. Достаточное реагенты при условии одинаковых 12-балльной дозовой кривые (в том числе один дН 2 O или ДМСО-контроля, установленным в зависимости реакции от дозы) для всех пяти 96-луночных планшетах. Соединений приведены на 250X концентрации (К-252, при условии максимального лечения 1 мкМ) или 10х (для акриламида и перекись водорода, принимая во внимание максимальную лечения 100 мм и 10 мм соответственно). Рекомендуемое лечение подготовка включает в себя половину журналов (1: √ 10) серийные разведения 250X соединения в ДМСО, с последующим разбавлением в соединения буфера разбавления до 10X (10X соединений контроль происходящие в дН 2 O может быть последовательно разбавлены непосредственно в стерильных дН 2 O Буфер соединения или разбавления). 10 мкл каждого лечения может быть добавлена в 90 мкл культуральной среды уже присутствуют в каждой лунке, для окончательного 1X концентрации (0,4% ДМСО или 10% дН 2 O). Пример данных осуществляется в течение 24 или 96 часов сложного лечения при 37 ° С до фиксации. Фиксация клеток и иммунофлуоресцентного окрашивания: Примечание: Окрашивание время составляет ~ 2,5 часа после фиксации. Не позволяйте лункам высыхать между окрашиванием шагов. Стремление и устроение реагентов следует проводить при низких скоростях потока уменьшить любую ячейку потери из-за сдвига жидкости. Все рекомендованные "на скважину" объемы относятся к одной скважины в 96-ю лунками. Все рекомендованные "в 96-луночного планшета" тома включают 25% избыточной для жидких потери объема обработки. Все окрашивания действия выполняются при комнатной температуре (RT). Все буферы и антител решения устойчивы, по крайней мере 24 часов при комнатной температуре. В конце периода культивирования, предварительно теплой ЖКХ Фиксация Решение (2X) до комнатной температуры (RT) или 37 º C при желании (12 mL/96-well пластины). В химический вытяжной шкаф, добавьте 100 мкл / лунку прямо на культуру средств массовой информации и позволяют фиксировать в течение 30 мин при комнатной температуре. Удалить фиксатором / токсин средах и распоряжаться им в соответствии с нормативами для опасных отходов (см. MSDS). Если немедленно приступить к окрашиванию, промыть каждую лунку в два раза с 200 мкл буфера ЖКХ иммунофлуоресценции. Или же, если пластины следует окрашенных в более позднее время, промойте в два раза с 200 мкл промывочного буфера, а затем оставить второго полоскания объем в скважинах и хранить пластины плотно закрытыми при температуре 4 º C до окрашивания. Если основные образцы были хранить при температуре 4 º C до окрашивания, промыть в два раза с 200 мкл ЖКХ иммунофлуоресценции буфера прежде чем приступать к окрашиванию протокола. Подготовка рабочего раствора Кролик Anti-βIII тубулина / мыши Anti-GFAP ЖКХ первичных антител (6 mL/96-well пластины) следующим образом: Добавить 60 мкл каждого талой первичных антител до 5,88 мл буфера ЖКХ иммунофлуоресценции. Хорошо перемешайте. Удалите предыдущие иммунофлуоресценции буфера полоскания. Добавить 50 мкл первичных антител решение в каждую лунку и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре. Удалить первичный антителрешение. Промыть в три раза с 200 мкл буфера ЖКХ иммунофлуоресценции. Подготовка рабочего раствора ЖКХ вторичными антителами / Hoechst ЖКХ ядерной пятна (6 mL/96-well пластины) следующим образом: Добавить 30 мкл каждого талой вторичными антителами и 30 мкл талой Hoechst ЖКХ ядерной пятна до 5,91 мл буфера ЖКХ иммунофлуоресценции. Хорошо перемешайте, защищая решение от света месте. Удалите предыдущие ЖКХ иммунофлуоресценции буфера полоскания. Добавить 50 мкл ЖКХ вторичными антителами / Hoechst ЖКХ ядерной пятно раствором и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре, в защищенном от света. Удалить ЖКХ вторичными антителами / Hoechst ЖКХ ядерной пятно раствором. Промыть два раза с 200 мкл буфера ЖКХ иммунофлуоресценции. Удалите предыдущие ЖКХ иммунофлуоресценции буфера полоскания. Промыть два раза с 200 мкл буфера ЖКХ промыть, оставляя вторую промыть объем в скважинах. Пластины печать и изображения сразу или хранить пластины при температуре 4 ° С в защищенном от света до готовности для работы с изображениями. Приобретение и анализа изображений: Работа с изображениями и анализ окрашенных пластин может осуществляться на различных доступных платформ ЖКХ, в том числе сотовый В Analyzer (GE Healthcare), ArrayScan (ThermoFisher Научно) или Opera (Perkin Elmer). Некоторые руководящие принципы для создания образов и анализа приведены в Таблице 1: HCS222 Руководство Image Acquisition Обнаружение реагент Объектив Возбуждение фильтра диапазона [пик / пропускной способности (нм)] Эмиссия фильтра диапазона [пик / пропускной способности (нм)] Hoechst ЖКХ ядерной пятно 20X 360/40 460/40 (или 535/50 при необходимости) ЖКХ вторичными антителами, FITC-Donkey анти-IgG кролика 20X 480/40 535/50 ЖКХ вторичными антителами, Cy-3-Donkey анти-IgG мыши 20X 535/50 600/50 HCS222 Руководство анализ изображений Сотовые параметров Обнаружение Сегментация / Измерение Обоснование Сотовый номер, ядерные характеристики Hoechst ЖКХ ядерной пятно Ядерная область (460 нм излучения канала). Подсчитать количество ядер. Содержание ДНК (ядерной интенсивности) или ядерной анализы области также возможны. Используйте номер ячейки, ядерные характеристики, чтобы определить потерю клеток, токсичности фенотипы и т.д. Может "фильтр" ядер для тех, кто связан с βIII-тубулина или GFAP выражение для получения отдельных нейронов и астроцитов клеток / характеристики (настоятельно рекомендуется). βIII-тубулина слова, аксонов ЖКХ вторичными антителами, FITC-сопряженных Цитоплазматическая области (535 нм излучения канала). FITC сигнала может быть использован для отличать тела нейронов из невриты (например, через минимальное / среднее тело клетки областях, минимальная / максимальная длина аксонов и ширины). Определить такие параметры, как общая длина аксонов, нейритов отсчетов / клетка и т.д. Измерения аксонов могут модулироваться при дифференциации нейронов, либо в результате химических травм, болезненных состояний и т.д. Может "фильтр" клеточных тел для тех, кто связан с βIII-тубулина выражение для получения различных характеристик нейронов (настоятельно рекомендуется). GFAP слова, астроцитов Площадь ЖКХ вторичными антителами, Cy-3-сопряженных Цитоплазматическая области (600 нм излучения канала). Cy3 сигнала может быть использован для определения астроцитарных цитоплазматических сегментации. Определить такие параметры, как средняя цитоплазматических интенсивность сигнала, мобильный области и т.д. GFAP выражения и астроцитов площадь ячейки может быть модулированных во астроцитов развития или в результате химической травмы, болезненных состояний и т.д. Может "фильтр" клеточных тел для тех, кто связан с GFAP выражение для получения различных астроцитарных характеристику (настоятельно рекомендуется). Таблица 1. Image Acquisition и анализа руководящих принципов – HCS222 βIII-Tubulin/GFAP (Со-культуры) Пробирной Представитель Результаты: Рисунок 1. βIII-тубулина и GFAP immunofluorescence смешанных крысы нейронных клеточных культурах. Сотрудничество культур первичных гиппокампа крысы астроциты либо с первичных нейронов гиппокампа крысы или крысы РС12 клетки были получены путем предварительного покрытия астроциты в течение нескольких дней в культуре, а затем нейронов посева. Первичная нейроны культивировали в течение еще 11 дней, а PC12s культивировали в течение дополнительных 2 дней при дифференциации условий (низкая сыворотки / NGF). Сотовые обработки, фиксации и иммунной были выполнены в соответствии с HCS222 протоколы анализа. Клетки были обследованы на GE В Сотовые Analyzer 1000 (3.3) на 20X (первичные нейроны) или 10X (РС12) цель увеличения и проанализированы с помощью GE В Сотовые Analyzer 1000 Workstation (3,4) нарост аксонов и мульти алгоритмы анализа целевой Верхняя панель.: Плавленый образы Hoechst ЖКХ ядерной пятна (синий), βIII-тубулина (зеленый) и GFAP (красный) флуоресценции. Отдельный анализ βIII-тубулина флуоресценции канал позволяет нейритов сегментации результат (в центре панели: клеточных тел, изложенные в синий (первичные нейроны) или желтого (РС12), невриты в зеленом (первичные нейроны) или голубой (РС12)). Анализ канала GFAP позволяет астроцитов сегментации (нижняя панель: ядра, изложенные в синий, цитоплазмы в зеленый цвет). GFAP сегментации для первичных нейронов гиппокампа крыс / астроцитов совместно культуры демонстрирует способность различать между ядрами / клеточных тел, которые GFAP (+) (зеленый очертания) и те, которые GFAP (-) (красный), что позволяет отдельным подсчитывает ячейки для нейроны и астроциты в смешанной настройка культуры. Рисунок 2. Доза ответы первичных нейронов гиппокампа крыс / астроцитов совместно культур токсичных напряжений. Первичная гиппокампа крысы астроциты (P6) высевали на 96-луночных планшетах в питательной среде и культивировали в течение 6 дней. Первичная гиппокампа крыс нейроны (напрямую из оттепель), затем были посеяны на вершине предварительно покрытием астроциты и культивировали в питательной среде в течение 11 дней. Клетки обрабатывали серийных разведений акриламида или перекись водорода (макс. концентрация = 100 мм и 10 мм соответственно) за последние 24 часа культуры. Сотовые обработки, фиксации и иммунной были выполнены в соответствии с HCS222 протоколы анализа. Клетки были обследованы на GE В Сотовые Analyzer 1000 (3.3) на 20X (10 полей / лунку) и проанализированы (ядерное / цитоплазматических / нейритов сегментации) с помощью GE В Сотовые Analyzer 1000 Workstation (3,4) нарост аксонов и мульти алгоритмы анализа Target. Представленные данные среднее ± SEM, п = 3. Несколько параметров (аксонов, GFAP интенсивности, астроцитов и нейронов области или астроцитарных-клеток) были исследованы зависимости от дозы тенденций.