Summary
Este artículo describe un nuevo protocolo y el reactivo conjunto diseñado para la medición sensible de los efectos neurotóxicos de los compuestos y los tratamientos en co-cultivos de neuronas y astrocitos utilizando el análisis de contenido de alta. Los resultados demuestran que el análisis de contenido de alta tecnología representa una apasionante novela para la evaluación de la neurotoxicidad.
Abstract
Análisis de contenido de alta (HCA) se combinan los ensayos de las células y los reactivos de detección con imágenes automatizada y potentes algoritmos de análisis de imagen, permitiendo la medición de varios fenotipos celulares dentro de un único ensayo. En este estudio, hemos utilizado HCA para desarrollar un ensayo novedoso para la neurotoxicidad. Neurotoxicidad evaluación representa una parte importante de la evaluación de seguridad de los medicamentos, además de ser un importante foco de los esfuerzos de protección del medio ambiente. Además, la neurotoxicidad es también una buena aceptación
Protocol
Preparación de células:
- Antes de la siembra de células de las neuronas ensayo de cultivo, / los astrocitos en medios de cultivo hasta ~ confluencia del 70-80% (menos que la siembra directa de células de deshielo o aislamiento).
- Separar las células de los frascos de cultivo / placas mediante el método adecuado para el tipo de células de interés. Si es necesario, cubra los pozos de la placa de ensayo con la proteína de la matriz poli-D-lisina o extracelular para mejorar la adhesión celular. Co-cultivos de astrocitos y neuronas se pueden sembrar de forma simultánea o secuencial. De cabezas de serie secuencial, placas de astrocitos por primera vez como "basal" de la capa se recomienda, seguido por la chapa y la diferenciación neuronal, si es necesario. Ajustar la densidad de células según sea apropiado para el tipo de células, el tiempo de la cultura posterior, los parámetros de interés, etc Dependiendo de la edad la cultura, fuente de células y la densidad de siembra, los cultivos primarios pueden variar considerablemente en la tasa de proliferación, la expresión de GFAP o crecimiento de las neuritas - es importante caracterizar y optimizar su sistema de células para proporcionar mayor relevancia biológica para su modelo experimental, así como para proporcionar imágenes de efectivos, la segmentación y el análisis de uso de HCS (ver Figura 1). Después de añadir las células a la placa (las células pueden ser sembradas en los medios de comunicación 90 l, para facilitar el tratamiento con la toxina como se describe en el Paso 3 a continuación), permiten que la placa de sentarse en una superficie plana a temperatura ambiente durante 15-30 minutos, lo que permite una distribución uniforme de la célula. Después de este período, las células se incuban en un medio de cultivo (37 ° C / 5% CO 2) por lo menos 24 horas, luego cambiar a la diferenciación de las condiciones de cultivo (por ejemplo, niveles séricos bajos / NGF de las células PC12), según corresponda. Al cultivo hasta que las células alcanzan el nivel deseado de confluencia o la diferenciación, el cambio de los medios de comunicación a intervalos apropiados para el tipo de célula.
- Los tratamientos con células (compuestos de control, los compuestos de ensayo, etc) se puede introducir en cualquier momento durante este período de la cultura, en su caso por el tiempo-curso de tratamiento de los intereses. Acrilamida, peróxido de hidrógeno y K-252a se proporcionan en forma de compuestos de control neurotóxicos. Suficientes reactivos se proporcionan para los duplicados de 12 puntos curvas de dosis-respuesta (incluyendo una dH 2 O o conjunto DMSO-control dentro de la relación dosis-respuesta) para los cinco placas de 96 pozos. Los compuestos se proporcionan en la concentración de 250X (para K-252a, en el supuesto de un tratamiento máximo de 1 mM) o 10 veces (de la acrilamida y el peróxido de hidrógeno, suponiendo que los tratamientos máximo de 100 mm y 10 mm, respectivamente). La preparación de tratamiento recomendado consiste en media-log (1: √ 10) series de dilución del compuesto 250X en DMSO, seguido de dilución en tampón de dilución del compuesto 10 veces (10 veces más compuestos de control de origen en dH 2 O puede ser diluido en serie directamente en estériles dH 2 O o tampón de dilución del compuesto). 10 l de cada tratamiento y luego se pueden añadir a los 90 l de medios de cultivo ya está presente en cada pozo, para una concentración final 1X (0,4% DMSO o el 10% dH 2 O). Datos de la muestra se proporciona por 24 o 96 horas de tratamiento compuesto a 37 ° C antes de la fijación.
Celular fijación y la tinción de inmunofluorescencia:
Nota: El tiempo de tinción es de ~ 2,5 horas posteriores a la fijación. No permita que los pozos se sequen entre los pasos de tinción. Aspiración y dispensación de los reactivos deben llevarse a cabo en las tasas de flujo bajo para disminuir la pérdida de células debido al corte del fluido. Todos los recomendados 'por así los volúmenes se refieren a un solo pozo de una microplaca de 96 pozos. Todos los recomendados 'por placa de 96 pocillos de los volúmenes de incluir un 25% superior para la pérdida de volumen de líquido de manejo. Todos los pasos de tinción se realiza a temperatura ambiente (TA). Todos los tampones y soluciones de anticuerpos se mantienen estables durante al menos 24 horas a temperatura ambiente.
- Al final del período de cultivo, pre-caliente solución de fijación HCS (2X) a temperatura ambiente (RT) o 37 º C si se desea (12 mL/96-well placa). En una campana para vapores químicos, añadir 100 ml / directamente bien a los medios de cultivo y permiten fijar durante 30 min a temperatura ambiente. Retire el fijador / que contiene la toxina y disponer de los medios de comunicación en cumplimiento de la normativa de residuos peligrosos (ver MSDS). Si procediendo de inmediato a las manchas, lavar cada pocillo dos veces con 200 uL de buffer HCS inmunofluorescencia. Por otra parte, si las placas están a teñir en un momento posterior, lavar dos veces con 200 l de tampón de lavado, deje segundo enjuague de volumen en los pozos y las placas de almacén cerrado herméticamente a 4 º C hasta que las manchas.
- Si las muestras de uso, han sido almacenadas a 4 º C antes de la tinción, lavar dos veces con 200 l de búfer HCS inmunofluorescencia antes de proceder con el protocolo de tinción.
- Prepare la solución de conejo anti-tubulina βIII / ratón anti-GFAP anticuerpos HCS Primaria (6 mL/96-well placa) de la siguiente manera: Añadir 60 l de cada anticuerpo primario descongelado a 5,88 ml de Buffer HCS inmunofluorescencia. Mezclar bien. Quitar Buffer inmunofluorescencia anterior enjuague. Añadir 50 l de solución de anticuerpo primario a cada pocillo e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Eliminar el anticuerpo primariosolución. Enjuáguese la boca tres veces con 200 l de búfer HCS inmunofluorescencia.
- Prepare una solución de trabajo de anticuerpos HCS Secundaria / HCS Hoechst tinción nuclear (6 mL/96-well placa) de la siguiente manera: Añadir 30 l de cada anticuerpo descongelado secundaria y 30 L de descongelado nuclear Hoechst HCS mancha a 5,91 ml de Buffer HCS inmunofluorescencia. Mezclar bien, la protección de solución de la luz. Quitar anterior HCS Buffer inmunofluorescencia enjuague. Añadir 50 l de anticuerpo secundario HCS / Hoechst HCS manchas solución nuclear y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente, protegido de la luz.
- Quitar HCS anticuerpo secundario / Hoechst HCS manchas solución nuclear. Enjuague dos veces con 200 l de búfer HCS inmunofluorescencia.
- Quitar anterior HCS Buffer inmunofluorescencia enjuague. Enjuague dos veces con 200 l de tampón de lavado HCS, dejando segundo enjuague de volumen en los pozos.
- Placa de placa de sello y la imagen de inmediato, o se almacenan a 4 º C protegido de la luz hasta que esté listo para la imagen.
Adquisición de imágenes y análisis:
- Imágenes y análisis de placas teñidas se puede realizar en una variedad de plataformas disponibles HCS, incluyendo el IN Cell Analyzer (GE Healthcare), ArrayScan (ThermoFisher Científico) u Opera (Perkin Elmer). Algunas pautas para la imagen y el análisis se presentan en la Tabla 1:
| HCS222 Directrices de adquisición de imágenes | |||
| Detección de los reactivos | Lente del objetivo | Rango de excitación del filtro [pico / ancho de banda (nm)] | Rango de emisión de filtro [pico / ancho de banda (nm)] |
| Hoechst tinción nuclear HCS | 20X | 360/40 | 460/40 (535/50 o si es necesario) |
| HCS secundaria de anticuerpos, FITC burro IgG anti-conejo | 20X | 480/40 | 535/50 |
| HCS secundaria de anticuerpos, Cy3-burro IgG anti-ratón | 20X | 535/50 | 600/50 |
HCS222 Directrices de Análisis de Imagen | |||
| Celda Parámetro | Detección | Segmentación / Medida | Razón fundamental |
| Número de celular, características nucleares | Hoechst tinción nuclear HCS | Región nuclear (460 nm de emisión del canal). Contar el número de núcleos. Contenido de ADN (intensidad nuclear) o análisis de la zona nuclear también son posibles. | Utilice el número de células, las características nucleares para determinar la pérdida de células, los fenotipos toxicidad, etc pueden "filtrar" los núcleos de los asociados con βIII-tubulina o la expresión de GFAP para obtener por separado los recuentos de células neuronales y los astrocitos / caracterizaciones (muy recomendable). |
| βIII-tubulina expresión, fruto de neuritas | HCS anticuerpo secundario, conjugado con FITC | Región citoplasmática (535 nm de emisión del canal). Señal de FITC puede ser utilizado para distinguir los cuerpos de células neuronales de las neuritas (por ejemplo, a través de las áreas del cuerpo mínimo / promedio de células, las longitudes de las neuritas mínimo / máximo y ancho). Determinar parámetros como la longitud de las neuritas total, cuenta con las neuritas / celulares, etc | Mediciones de las neuritas consecuencia puede ser modulada durante la diferenciación neuronal o como consecuencia de una lesión química, los estados de enfermedad, etc pueden "filtrar" los cuerpos celulares de las asociadas con la expresión βIII-tubulina para obtener la caracterización distinta neuronal (muy recomendable). |
| La expresión de GFAP, Zona de astrocitos | HCS anticuerpo secundario, conjugado con Cy3 | Región citoplasmática (600 nm de emisión del canal). Cy3 señal puede ser utilizada para definir la segmentación del citoplasma astrocíticos. Determinar parámetros como la intensidad media de la señal citoplásmica, área de la celda, etc | Expresión de GFAP y el área celular de astrocitos puede ser modulada durante el desarrollo de los astrocitos o como consecuencia de una lesión química, los estados de enfermedad, etc pueden "filtrar" los cuerpos celulares de las relacionadas con la expresión de GFAP para obtener la caracterización distinta astrocíticos (muy recomendable). |
Tabla 1. Adquisición de imágenes y análisis de las Directrices - HCS222 βIII-Tubulin/GFAP (Co-cultivo) Ensayo
Los resultados representativos:
Figura 1. βIII-tubulina y immunofluore GFAPscence de cultivos mixtos de células nerviosas de ratas.
Co-cultivos de astrocitos de hipocampo de rata primaria, ya sea con las neuronas del hipocampo de rata primaria o PC12 células de rata se han generado por los astrocitos pre-revestimiento de varios días en la cultura, seguido por la siembra de las neuronas. Neuronas primarias fueron cultivadas por un período adicional de 11 días, mientras que PC12s se cultivaron durante 2 días en condiciones de diferenciación (niveles séricos bajos / NGF). Manipulación de células, la fijación y tinción se realizó de acuerdo a HCS222 protocolos de ensayo. Las células fueron fotografiadas en el GE EN Celular Analizador de 1000 (3.3) a 20X (neuronas primarias) o 10x (PC12) aumento del objetivo y se analizaron con el analizador de GE En la celda de estación de trabajo 1000 (3.4) y el crecimiento de las neuritas múltiples algoritmos de análisis objetivo del panel superior.: imágenes fusionadas de Hoechst HCS manchas Nuclear (azul), βIII-tubulina (verde) y GFAP (rojo) de fluorescencia. Análisis por separado del canal de fluorescencia βIII-tubulina permite la segmentación crecimiento de las neuritas (panel del medio: los cuerpos celulares con un contorno azul (neuronas primarias) o amarillo (PC12), neuritas en verde (neuronas primarias) o azul claro (PC12)). Análisis de los canales de GFAP permite la segmentación de astrocitos (panel inferior: núcleos con un contorno azul, el citoplasma de color verde). Segmentación GFAP para la rata primaria neuronas del hipocampo / co-cultivo de astrocitos demuestra la capacidad de distinguir entre los órganos de núcleos / célula que son GFAP (+) (Verde describe) y los que son GFAP (-) (rojo), lo que cuenta por separado para celulares neuronas y astrocitos en un ambiente de cultivo mixto. 
Figura 2. Respuestas dosis de rata primaria neuronas del hipocampo / co-cultivos de astrocitos a las tensiones tóxicas.
Astrocitos de hipocampo de rata primaria (P6) se sembraron en placas de 96 pozos en los medios de cultivo y se cultivaron durante 6 días. Neuronas primarias de hipocampo de rata (directo de deshielo) se sembraron luego en la parte superior de la pre-plateado astrocitos y cultivo en medios de cultivo durante 11 días. Las células fueron tratadas con diluciones seriadas de peróxido de hidrógeno o de acrilamida (concentraciones máximo = 100 mm y 10 mm, respectivamente) para las últimas 24 horas de la cultura. Manipulación de células, la fijación y tinción se realizó de acuerdo a HCS222 protocolos de ensayo. Las células fueron fotografiadas en el GE EN Celular Analizador de 1000 (3.3) a 20X (10 campos / pocillo) y se analizaron (nuclear / citoplasmática / neuritas segmentación), utilizando el GE EN Celular Analizador de estación de trabajo 1000 (3.4) y el crecimiento de las neuritas múltiples algoritmos de análisis objetivo. Los datos presentados son la media ± SEM, n = 3. Varios parámetros (crecimiento de las neuritas, la intensidad de GFAP, área de los astrocitos y los recuentos de células neuronales o astrocitos) fueron investigados por dosis-dependiente de las tendencias.
Discussion
Hasta la fecha, los experimentos in vitro diseñado para estudiar la evaluación de la neurotoxicidad de riesgo utilizando cultivos mixtos de neuronas y astrocitos han sido limitados. Es ampliamente aceptado que las células gliales son esenciales en la prestación de apoyo espacial y metabólica de las neuronas y juegan un papel fundamental en la modulación de diversas funciones neuronales, como la migración neuronal, la diferenciación y la actividad sináptica. Astrocitos gliales también liberan citoquinas y otros factores solubles que son capaces de inducir la tolerancia tanto en las respuestas adversas en los alrededores de tejido neuronal, así como la promoción de las neuronas de muchas toxinas. Demostrando la profundidad de interacción neuronal-glial, en los estudios de co-cultivo, los astrocitos se ha demostrado que protegen a las neuronas contra la toxicidad del estrés oxidativo, mientras que el deterioro de las funciones de los astrocitos, como el mantenimiento de la defensa antioxidante y los niveles de energía celular, se ha demostrado que críticamente influir en la supervivencia neuronal. Estudios recientes han sugerido que el uso de los astrocitos en un ensayo in vitro de la neurotoxicidad del sistema puede resultar más relevante para la salud humana la estructura del sistema nervioso central y la función de las células neuronales solo. A pesar de la creciente conciencia de la importancia fisiológica de las neuronas, los astrocitos interacciones, que ya ha sido difícil de realizar análisis cuantitativos de estas interacciones en células intactas. El advenimiento de filtrado de contenido de alta permite el desarrollo de poderosos nuevos ensayos para abordar esta cuestión.
En este estudio, hemos demostrado que el análisis cuantitativo de varios fenotipos neuronales y los astrocitos en un único ensayo son posibles gracias a HCA. En las neuronas primarias que han realizado las mediciones cuantitativas de los marcadores de neurotoxicidad como el número de neuronas, y la longitud de las neuritas contar las neuritas. En los astrocitos, gliosis reactiva es un marcador biológico conocido de la neurotoxicidad, caracterizada por alteraciones en la expresión de GFAP, el número de astrocitos y la morfología de los astrocitos. Hemos demostrado que cada uno de estos criterios de valoración puede ser fácilmente evaluada a través de HCA. Estos estudios apoyan el concepto de que el HCA de nervios específicos biomarcadores podría ser utilizado como parte de una batería de pruebas in vitro para detectar rápidamente grandes cantidades de productos químicos para los puntos finales neurotóxicos.
HCS222 kit de alta Millipore análisis de contenido de co-cultivo de neuronas y astrocitos se compone de reactivos de detección de alta calidad y protocolos para la creación de perfiles simultáneamente βIII-tubulina y la proteína glial fibrilar ácida (GFAP) en una amplia variedad de modelos celulares de neurotoxicidad. Los reactivos altamente validados suministrado con el kit permiten al usuario estandarizar los ensayos, minimizar el ensayo a ensayo de la variabilidad, y para generar imágenes de forma reproducible con una elevada relación señal-a-fondo de relación.
Disclosures
Los autores son todos los empleados de Millipore Corporation.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a los Dres. Rick Ryan, Umesh Patel, hasta que Jeff Hsu Mateo, Mistry Jehangir y Michele Hatler de apoyo durante el desarrollo de estos proyectos y los protocolos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit Anti-βIII-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201672 | 1 vial containing 300 μL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X | Part No. CS201649 | 1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201671 | 1 vial containing 300 μL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X | Part No. CS200437 | 1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| H–chst HCS Nuclear Stain, 200X | Part No. CS200438 | 1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X | Part No. CS200434 | 1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Immunofluorescence Buffer, 1X | Part No. CS200435 | 1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Wash Buffer, 1X | Part No. 2007643 | 1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components |
|
| Acrylamide (Control Compound), 10X | Part No. CS201679 | 1 vial containing 500 μL of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component |
|
| Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X | Part No. CS201730 | 1 vial containing 500 μL of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components |
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| K-252a (Control Compound), 250X | Part No. CS201741 | 1 vial containing 100 μL of 250 μM K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component |
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| DMSO for Compound Serial Dilution | Part No. CS200441 | 1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Compound Dilution Buffer | Part No. CS200442 | 1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Plate Sealers | Part No. CS200443 | 10 each Millipore HCS222 Kit Components |
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| tissue culture-treated black/clear bottom microplates | |||
| HCS imaging/analysis system |
References
- Radio, N. M., Mundy, W. R. Developmental neurotoxicity testing in vitro: models for assessing chemical effects on neurite outgrowth. Neurotoxicology. 29, 361-376 (2008).
- Richards, G. R., Smith, A. J., Parry, F., Platts, A., Chan, G. K., Leveridge, M., Kerby, J. E., Simpson, P. B. A morphology- and kinetics-based cascade for human neural cell high content screening. Assay Drug Dev Technol. 4, 143-152 (2006).
- Evans, N. A., Facci, L., Owen, D. E., Soden, P. E., Burbidge, S. A., Prinjha, R. K., Richardson, J. C., Skaper, S. D. Abeta(1-42) reduces synapse number and inhibits neurite outgrowth in primary cortical and hippocampal neurons: A quantitative analysis. J Neurosci Methods. 175, 96-103 (2008).
- Breier, J. M., Radio, N. M., Mundy, W. R., Shafer, T. J. Development of a high-throughput screening assay for chemical effects on proliferation and viability of immortalized human neural progenitor cells. Toxicol Sci. 105, 119-133 (2008).
- Radio, N. M., Breier, J. M., Shafer, T. J., Mundy, W. R. Assessment of chemical effects on neurite outgrowth in PC12 cells using high content screening. Toxicol Sci. 105, 106-118 (2008).
- Harry, G. J., Tiffany-Castiglioni, E. Evaluation of neurotoxic potential by use of in vitro systems. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 1, 701-713 (2005).
- Prockop, L. D. The allegory of a mountain: an environmental introduction to neurotoxicology. J Neurol Sci. 262, 7-14 (2007).
- Woehrling, E. K., Hill, E. J., Coleman, M. D. Development of a neurotoxicity test-system, using human post-mitotic, astrocytic and neuronal cell lines in co-culture. Toxicol In Vitro. 21, 1241-1246 (2007).
- Holden, L. J., Coleman, M. D. Assessment of the astrogliotic responses of three human astrocytoma cell lines to ethanol, trimethyltin chloride and acrylamide. Toxicology. 241, 75-83 (2007).
- Röhl, C., Lucius, R., Sievers, J. The effect of activated microglia on astrogliosis parameters in astrocyte cultures. Brain Res. 1129, 43-52 (2007).
- Eng, L. F., Ghirnikar, R. S., Lee, Y. L. Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000). Neurochem Res. 25, 1439-1451 (2000).
- Gadea, A., Schinelli, S., Gallo, V. Endothelin-1 regulates astrocyte proliferation and reactive gliosis via a JNK/c-Jun signaling pathway. J Neurosci. 28, 2394-2408 (2008).
- O'Callaghan, J. P., Sriram, K. Glial fibrillary acidic protein and related glial proteins as biomarkers of neurotoxicity. Expert Opin Drug Saf. 4, 433-442 (2005).
- Mead, C., Pentreath, V. W. Evaluation of toxicity indicators in rat primary astrocytes, C6 glioma and human 1321N1 astrocytoma cells: can gliotoxicity be distinguished from cytotoxicity? Arch Toxicol. 72, 372-380 (1998).
- Balls, M., Walum, E. Chapter 11: towards the acceptance of in vitro neurotoxicity tests. Neurotoxicology In Vitro. , Taylor and Francis. London. 269-283 (1999).
- Yokosuka, M., Ohtani-Kaneko, R., Yamashita, K., Muraoka, D., Kuroda, Y., Watanabe, C. Estrogen and environmental estrogenic chemicals exert developmental effects on rat hypothalamic neurons and glias. Toxicol In Vitro. 22, 1-9 (2008).
- Weible, M. W., Chan-Ling, T. Phenotypic characterization of neural stem cells from human fetal spinal cord: synergistic effect of LIF and BMP4 to generate astrocytes. Glia. 55, 1156-1168 (2007).
- Casulari, L. A., Melcangi, R. C., Piva, F., Martini, L., Maggi, R. Factors released by rat type 1 astrocytes exert different effects on the proliferation of human neuroblastoma cells (SH-SY5Y) in vitro. Endocr Relat Cancer. 7, 63-71 (2000).
- Dringen, R., Gutterer, J. M., Hirrlinger, J. Glutathione metabolism in brain metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species. Eur J Biochem. 267, 4912-4916 (2000).
- Cristòfol, R. M., Gassó, S., Vílchez, D., Rodríguez-Farré, E., Sanfeliu, C. Neurotoxic effects of trimethyltin and triethyltin on human fetal neuron and astrocyte cultures: a comparative study with rat neuronal cultures and human cell lines. Toxicol Lett. 152, 35-46 (2004).
