توضح هذه المقالة بروتوكول الرواية وكاشف مجموعة مصممة لقياس التأثيرات السمية العصبية الحساسة للمركبات والعلاجات على الثقافات المشتركة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية باستخدام عالية تحليل المحتوى. تظهر النتائج ان ارتفاع تحليل المضمون يمثل تكنولوجيا جديدة مثيرة لتقييم العصبية.
ارتفاع تحليل المحتوى (HCA) المقايسات دمج الخلايا والكواشف مع التصوير الآلي وقوية خوارزميات تحليل الصور ، مما يسمح بقياس الظواهر الخلوية متعددة ضمن مقايسة واحد. في هذه الدراسة ، استخدمت نحن HCA لوضع مقايسة رواية عن العصبية. العصبية التقييم يمثل جزءا هاما من تقييم سلامة العقاقير ، فضلا عن كونها والتركيز بشكل كبير من جهود حماية البيئة. بالإضافة إلى ذلك ، العصبية هي أيضا جيدة مقبولة<em> في المختبر</em> علامة لتطور الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر وأمراض الشلل الرعاش. مؤخرا ، تم الإبلاغ عن تطبيق HCA لفحص الخلايا العصبية. وذلك عبر تسمية الخلايا العصبية مع βIII – تويولين ، يمكن توفير فحوصات HCA الإنتاجية العالية ، وعدم الموضوعية ، والقياسات الكمية من المعلمات مثل عدد الخلايا العصبية ، والعد neurite neurite طول ، والتي يمكن أن تشير إلى التأثيرات السمية العصبية. ومع ذلك ، لا تزال غير مستكشفة دور الخلايا النجمية في هذه النماذج. النجمية يكون لها دور أساسي في الحفاظ على النظام العصبي المركزي (CNS) التوازن ، وترتبط مع كل من العصبية وneurodegradation عندما يتم تفجيرها في الاستجابة للمواد السامة أو الحالات المرضية. GFAP هو بروتين خيوط المتوسطة وأعرب في الغالب في الخلايا النجمية للجهاز العصبي المركزي. تفعيل نجمي (دباق) يؤدي إلى upregulation من GFAP ، يرافقه عادة من قبل الانتشار نجمية وتضخم. وقد اقترح هذه العملية من دباق رد الفعل باعتباره علامة مبكرة على حدوث ضرر للجهاز العصبي. الطريقة التقليدية لGFAP الكميات حسب المناعية. ويقتصر هذا النهج وعدم القدرة على توفير المعلومات عن التوطين الخلوية ، ومورفولوجيا وعدد الخلايا. مصممون التي يمكن استخدامها للتغلب على هذه HCA القيود ولقياس ميزات متعددة في وقت واحد المرتبطة دباق — التغيرات في التعبير GFAP ، وتضخم نجمية ، وانتشار نجمية — ضمن مقايسة واحد. في المشاركة في دراسات ثقافة ، وقد تبين أن الخلايا النجمية لحماية الخلايا العصبية ضد عدة أنواع من وسامة وإهانة خطيرة للتأثير على بقاء الخلايا العصبية. وقد اقترحت الدراسات الحديثة أن استخدام الخلايا النجمية في<em> في المختبر</em> قد تثبت نظام اختبار العصبية أكثر ملاءمة لبنية الإنسان وظيفة الجهاز العصبي المركزي من الخلايا العصبية وحدها. تبعا لذلك ، لدينا ضعت مقايسة HCA للثقافة مشتركة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية ، التي تتألف من البروتوكولات والتحقق من صحتها والكواشف محددة الهدف الكشف عن التنميط βIII – تويولين الدبقية وبروتين لييفي الحمضية (GFAP). هذا الاختبار يمكن تحليل العصبية في وقت واحد ، neurite ثمرة ، دباق ، مورفولوجيا الخلايا العصبية والخلايا العصبية والتنمية نجمي ونجمي في طائفة واسعة من النماذج الخلوية ، وهو ما يمثل الرواية ، غير ذاتية ، والإنتاجية العالية مقايسة لتقييم العصبية. في مقايسة يحمل امكانات كبيرة للكشف عن العصبية تعزيز وتحسين الإنتاجية في مجال البحوث والأعصاب اكتشاف المخدرات.
حتى الآن ، في التجارب المختبرية تهدف إلى دراسة وتقييم المخاطر العصبية باستخدام ثقافات مختلطة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية كانت محدودة. فمن المعروف جيدا أن الخلايا الدبقية المقبولة هي جزء لا يتجزأ في تقديم الدعم المكاني والتمثيل الغذائي للخلايا العصبية ، وتلعب دورا حاسما في وظائف عدة تحوير الخلايا العصبية ، الخلايا العصبية بما في ذلك الهجرة ، والتمايز والنشاط متشابك. الخلايا النجمية الدبقية أيضا إطلاق سراح السيتوكينات وعوامل أخرى قابلة للذوبان والتي هي قادرة على التسامح على حد سواء العصبية تحفيز استجابات معاكسة في الأنسجة المحيطة العصبية ، فضلا عن تشجيع العديد من السموم. مما يدل على عمق التفاعلات العصبية – الدبقية ، وشارك في دراسات ثقافة ، وقد تبين أن الخلايا النجمية لحماية الخلايا العصبية ضد سمية الاكسدة ، في حين لم تظهر ضعف وظائف نجمي ، مثل الصيانة للدفاع المضادة للأكسدة ، ومستويات الطاقة الخلوية ، إلى تأثير حاسم بقاء الخلايا العصبية. وقد اقترحت الدراسات الحديثة أن استخدام الخلايا النجمية في اختبار النظام في المختبر العصبية قد تكون أكثر أهمية للإنسان هيكل الجهاز العصبي المركزي وظيفة من الخلايا العصبية وحدها. على الرغم من الوعي المتزايد لأهمية الفسيولوجية العصبية ، نجمي التفاعلات ، فقد كان في السابق من الصعب إجراء تحليل الكمي لهذه التفاعلات في خلايا سليمة. ظهور فحص نسبة عالية تمكن من تطوير فحوصات جديدة وقوية لمعالجة هذا الأمر.
في هذه الدراسة ، وقد أثبتنا أن يتم إجراء تحليلات كمية من الظواهر المتعددة ونجمي الخلايا العصبية داخل مقايسة واحدة بفضل HCA. في الخلايا العصبية الأولية قد أجرينا القياسات الكمية من علامات العصبية مثل عدد الخلايا العصبية ، وطول العد neurite neurite. في الخلايا النجمية ، دباق رد الفعل هو معروف من العلامات البيولوجية العصبية ، التي تتميز التعديلات في التعبير GFAP ، وعدد نجمية ومورفولوجيا نجمية. لقد أثبتنا التي قد بسهولة كل من هذه النهاية أن تقيم عبر HCA. هذه الدراسات مفهوم الدعم التي يمكن أن تستخدم HCA من المؤشرات الحيوية العصبية محددة كجزء من مجموعة من التجارب في المختبر لفحص السريع لأعداد كبيرة من المواد الكيميائية بالنسبة لنهايات أعصاب.
وتتألف لميليبور HCS222 تحليل محتوى عال عدة للثقافة مشتركة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية من الكواشف ذات جودة عالية وبروتوكولات للالتنميط في وقت واحد ، βIII تويولين والدبقية ييفي البروتين الحمضية (GFAP) في طائفة واسعة من النماذج من العصبية الخلوية. الكواشف عالية التحقق المقدمة مع هذه المجموعة تسمح للمستخدم لتوحيد المقايسات ، والحد من مقايسة إلى مقايسة تقلباته ، وتوليد الصور بتكاثر مع نسبة إشارة إلى خلفية عالية.
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكاترة. ريك ريان ، أوميش باتل ، وحتى جيف هسو ماثيو ، ميستري جيهانجير وميشيل Hatler للحصول على دعم خلال تطوير هذه المشاريع والبروتوكولات.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Rabbit Anti-βIII-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201672 | 1 vial containing 300 µL Millipore HCS222 Kit Component |
||
HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X | Part No. CS201649 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
||
Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201671 | 1 vial containing 300 µL Millipore HCS222 Kit Component |
||
HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X | Part No. CS200437 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
||
Hoechst HCS Nuclear Stain, 200X | Part No. CS200438 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
||
HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X | Part No. CS200434 | 1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component |
||
HCS Immunofluorescence Buffer, 1X | Part No. CS200435 | 1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component |
||
HCS Wash Buffer, 1X | Part No. 2007643 | 1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components |
||
Acrylamide (Control Compound), 10X | Part No. CS201679 | 1 vial containing 500 µL of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component |
||
Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X | Part No. CS201730 | 1 vial containing 500 µL of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components |
||
K-252a (Control Compound), 250X | Part No. CS201741 | 1 vial containing 100 µL of 250 µM K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component |
||
DMSO for Compound Serial Dilution | Part No. CS200441 | 1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component |
||
Compound Dilution Buffer | Part No. CS200442 | 1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component |
||
Plate Sealers | Part No. CS200443 | 10 each Millipore HCS222 Kit Components |
||
tissue culture-treated black/clear bottom microplates | ||||
HCS imaging/analysis system |