Summary
Мы опишем простой протокол для идентификации белков мозга, которые связывают с полной конечной длины C АТФ закрытого P2X2 рецепторов. Расширение и систематическое применение этого подхода ко всем Р2Х рецепторов, как ожидается, приведет к лучшему пониманию сигнализации рецептора Р2Х.
Abstract
Лиганд-ионные каналы лежат в основе синаптической связи в нервной системе 1. У млекопитающих Есть три семейства лиганд закрытого канала: цис цикла, глутамат-закрытого типа, и Р2Х каналов рецепторов 2. В каждом случае связывания передатчика приводит к открытию поры, через которые ионы стекают их электрохимического градиента. Многие лиганд-закрытый каналы также проницаемой для ионов кальция, 3, 4, которые ниже по течению сигнализации ролей 5 (например, регуляции генов), которые могут превышать длительность канал открытия. Таким образом лиганд закрытого канала может сигнализировать о более широком масштабе времени от нескольких миллисекунд до нескольких дней. Учитывая эти важные роли надо понять, как лиганд закрытого ионных каналов сами регулируются белками, и как эти белки могут настроить сигнализацию. Последние исследования показывают, что многие, если не все, каналы могут входить в состав белка сигнализации комплексы 6. В этой статье мы объясним, как идентифицировать белки, которые связываются с С-концевой аспекты P2X2 рецептор цитозольного домена.
Р2Х рецепторы АТФ-каналов закрытого катионов и состоит из семи подразделений (P2X1-P2X7). Р2Х рецепторы широко выражается в головной мозг, где они посредником возбуждающие синаптической передачи и пресинаптического облегчения нейромедиатора выпуска 7. Р2Х рецепторы находятся в возбудимых и не возбудимых клеток и посредником ключевую роль в нейронной сигнализации, воспаление и сердечно-сосудистой функции 8. P2X2 рецепторы широко распространены в нервной системе, а 9 находятся в центре внимания данного исследования. Каждая субъединица Р2Х, как полагают, обладают двумя мембрану сегментов (TM1 и TM2), разделенных внеклеточной области 7 и внутриклеточных N и С, концы (рис. 1а) 7. Р2Х подразделения 10 (P2X1-P2X7) показывают 30-50% последовательность гомологии на уровне аминокислот 11. Р2Х рецепторы содержат только три подразделения, что является самым простым стехиометрии среди ионотропных рецепторов. P2X2 С-конца состоит из 120 аминокислот (рис. 1б) и содержит несколько сайтов стыковочного белка консенсуса, в пользу гипотезы, что P2X2 рецепторов может быть частью сигнализации комплексов. Однако, несмотря на несколько функций были отнесены к С-конце P2X2 рецепторов 9 ни одно исследование не описаны молекулярные партнеров, которые пару к внутриклеточной стороне этого белка по всей длине C-конца. В этой статье мы опишем методы протеомных подход к определению белков, которые взаимодействуют с полной длины С-конце P2X2 рецепторов.
Protocol
Экспериментальных процедур
Методика эксперимента (рис. 2) состоит из четырех частей, которые описаны в поэтапно ниже.
Часть 1: Субклонирование и выражение С-конце P2X2 рецепторов.
Мы выразили полную длину С-конце P2X2 рецепторов у бактерий для идентификации белков мозга, к которым она связывает.
- С-концом (остатки 353-472) из P2X2 рецепторов (рис. 1) был усилен с помощью ПЦР, клонировали в pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) и проверяться с помощью секвенирования.
- Рекомбинантная плазмида была преобразована в E. Coli (BL21) для экспрессии рекомбинантных белков.
- Глицерин запасы бактерии (кишечная палочка BL21), содержащий P2X2 CT-GST плазмиды были соскабливают стерильным наконечником пипетки и засевают в 5 мл Лурия-Бертани (LB) средств массовой информации с соответствующими селективного маркера (50 г / мл ампициллина) и инкубировали в течение ночи в орбитальном шейкере при 37C.
- Культуры выращивали в течение ночи были привиты в 250 мл LB среды с подходящим антибиотиком (50 мкг / мл ампициллина) и инкубировали в орбитальном шейкере при 250 оборотов в минуту в течение 2-3 часов при 37 ° C до оптической плотности при 600 нм достигала ~ 0,6-0,7.
- Культуры вызывали с 1 мМ IPTG и далее инкубировали при 37С в течение 3 часов для экспрессии белка.
- Культуры был тогда центрифугировали при 5000 г в течение 15 мин при 4С (1 мл культуры было сохранено для анализа уровня экспрессии и маркированы как «индуцированных»). Супернатант отбрасывают, а осадок ресуспендировали в 20 мл физиологического раствора Трис-ЭДТА (STE) буфера (10 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА рН 8,0).
- Подвески была выделена в 5000 г в течение 15 мин в 50 мл трубки сокола. Супернатант отбрасывают и полусухие осадок замораживают при-70С на ночь.
- -70C осадок ресуспендировали в 40 мл ледяной буфера для лизиса (2% (м / о) sarkosyl, 15 мг лизоцима, 150 мМ NaCl, 50 мМ Трис pH7.5, 5 мМ ДТТ и полную таблетку ингибитор протеазы) , и суспензию инкубировали на льду в течение 30 мин. Во время этой инкубации, 3 мл глутатион-сефарозой 4B шарики промывали 20 мл фосфатного буфера физиологического раствора (PBS) и 20 мл Т-би-эс (0,1% (об. / об) tritonX-100 в PBS), а затем ФСБ. Бисер ресуспендировали в 1 мл PBS.
- Бактериальной суспензии замораживания-талой 3 раза в жидком азоте и ультразвуком (1с вкл / выкл, 30 микрон в течение 3 минут на льду) и далее инкубировали в течение 30 минут с 4% (объем / объем) тритона Х-100, 10 мМ MgSO 4 и 2 мМ АТР на льду.
- Лизат центрифугировали при 20000 г в течение 15 мин при 4С и осадок отклонены (выборка из гранул и 1 мл надосадочной был сохранен для страницы SDS для проверки количества белков в цитоплазме и мембран). Супернатант инкубируют с бисером в течение 1 часа (или на ночь) при 4С.
- Бусины были выделены на 500 г в течение 5 мин и супернатант был отброшен (образец был сохранен для несвязанных фракция). Бисер промывали PBS Т-пять раз (моет были спасены для мытья управления).
- Затем шарики ресуспендировали в ФБР, чтобы дать 50% (вес / объем) раствора и хранят в холодильнике при 4С до использования. Концентрация белка была оценена Бредфорда (в соответствии с инструкциями производителя).
Часть 2: Подготовка всего лизатах мозга
P2X2 рецепторов, как известно, обильно выразил в головном мозге 8. В настоящее время анализов, мы попытались выявить белки, взаимодействующие с P2X2 рецепторов крысы целом лизатов головного мозга (рис. 3).
- Взрослый головного мозга крыс было заготовлено (животные были принесены в жертву в соответствии с UCLA IAACUC-утвержденного протокола и в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных) и промыть сразу ледяной PBS (3X).
- Лизировать клетки 10 мл (~ 5 раз сырого веса заготовленной мозга) ледяного буфера для лизиса, содержащего 150 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 10 мМ ЭДТА, 1 мМ EGTA, 1 мМ NaF, 1 мМ Na 3 VO 4, 1 мМ PMSF, 5 мкг / мл leupeptin, 1% (об. / об) NP-40, и коктейль ингибиторов протеазы таблетки был добавлен в собранных мозга.
- Мозговая ткань гомогенизировали на льду с гомогенизатор Dounce стекла, пока смесь однородной консистенции была достигнута.
- Сотовые лизат была выделена в 2000 г в течение 5 минут, чтобы удалить непрерывной клеток. Супернатант собирают и вращается снова в 29000 г в течение 60 минут, чтобы удалить нетронутыми органелл и мембран агрегатов.
- Сразу же после центрифугирования супернатант был переведен в чистую пробирку. Концентрация белка в целом лизат мозга измерялась с помощью анализа Брэдфорда (обычно ~ 15 мг / мл).
- Лизат аликвоты и хранили при температуре-70С.
Часть 3: Выделение P2X2 C-хвост белков, связанных с
Чтобы определить обязательными партнерами P2X2 CT-GST из цельного лизатов головного мозга, выпадающее анализ был выполнен с помощью КТ-GST иммобилизованных на глутатион сефарозе бисером 4B в качестве приманки. Для элементов управления, стоимость одного связан с бисером был использован.
- Мозг лизат precleared с бисером и стоимость за 1 час при 4С. Осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость была использована для дальнейшего анализа.
- Равные количества GST и P2X2 CT-GST (10 мкг), связанные с глутатион сефарозе 4 B бисером инкубировали в течение ночи со 100 г precleared растворяют белки из крыс целом лизат мозга, с поворотом на 4C в лизис буфера.
- Бусины были выделены в 1000 г в течение 5 мин и супернатант отбрасываются.
- Бисер промывали один раз лизис буфера и варят в изменение Laemli буфера [4% (м / о) SDS, 10% (об. /) 2-меркаптоэтанол, 2% (объем / объем) глицерин, 0,004% (в / у) бромфенола синий и 0,125 М TrisCl рН 6,8] в течение 5 мин.
- Образцы были выделены в 5000 г в течение 5 мин и супернатант разделенных на 10% SDS-PAGE (рис. 4). Гели окрашивали SYPRO Рубин белка гель пятна (в соответствии с инструкциями производителя) и визуализируется в ультрафиолетовом свете. P2X2 CT-связанных белков по сравнению с теми, получен с помощью программы GST-нуль в качестве приманки. Четыре биологических Были проведены серии (т.е. четыре мозги и четыре независимых падения тянуть).
Часть 4: Идентификация белков.
Белки отделить помощью гель-электрофореза вырезали из геля и определили методом масс-спектрометрии 12. Примечание: отсутствие пыли на протяжении всего процесса имеет решающее значение для снижения загрязнения кератина. Экспериментатор должен носить маску, за вычетом волосами и перчатки во все времена и никогда не касаются гель области интереса, без использования перчаток.
- Все видимые белковых полос оправился от P2X2 выпадающем вырезали с чистым лезвием бритвы и нарезанный кубиками (рис. 4). Корреспондент регионов геля в GST-нуль выпадающем переулок были вырезаны таким же образом, без учета группы окраски (полосы, специфичные для GST-нуль приманки были вырезаны и определили), чтобы гарантировать, что наличие белка ниже уровня окрашивание чувствительность не был пропущен.
- Гель части инкубировали с 200 мкл 50 мМ бикарбоната аммония в 50% (об. / об) ацетонитрила (АКС) и труб перемешивали в течение 15 мин при комнатной температуре. Повторите этот шаг мыть.
- Гель части были обезвоженной путем добавления 200 мкл ацетонитрила (гель части должны сокращаться и становятся непрозрачными в цвете).
- Acetontrile был удален и гель части сушат в speedvac в течение ~ 10 мин.
- Гель части были затем инкубировали с 30 мкл свежеприготовленного 10 мМ DTT/10 мМ трис (2-карбокси-этил) фосфин гидрохлорид (TCEP) в достаточном объеме, чтобы погрузить кусочки. Это было оставлено в течение 30 минут при температуре 56C водяную баню.
- Следующее решение DTT была заменена на 100 мкл 500 мМ бикарбоната аммония в 50% ацетонитрила раствор и гель ломтиками промывают ammounium бикарбоната.
- Моющий раствор отсасывали и 200 мкл ацетонитрила добавили для обезвоживания гели.
- Ацетонитрил удаляли и 100 мкл свежеприготовленного 100 мМ iodoacetamide раствор добавляли к алкилата свободной sulfhydryls. Этот шаг приступил в течение 25 мин при комнатной температуре в темноте.
- Iodoacetamide раствор удаляли и гель части промывали 200 мкл 50 мМ бикарбоната аммония в 50% acetontrile (рН 8,0) в течение 2 мин в то время как вортексе. Этот шаг был мыть повторяется.
- После удаления промывочного раствора, геля части инкубировали с 200 мкл ацетонитрила который затем был удален speedvac в течение ~ 10 мин.
- На данном этапе гель части готовы к перевариванию трипсина. Гель части инкубировали в 30 мкл раствора трипсина (20 нг / мкл рабочей концентрации) и помещают на лед в течение 10 мин для гелей, хорошо опухшие. Превышение трипсина был удален и регидратации гелевых частиц с наложением 30 мкл с 50 мМ бикарбоната аммония, чтобы держать их погруженными всей пищеварения, которой было разрешено приступить в течение 12 до 16 часов при 37С.
- Пять мкл 5% (об. / об) Муравьиная кислота добавляется для отключения трипсина и арест пищеварения.
- Пробирки встряхивали в течение ~ 15 мин и центрифугировали кратко привести жидкость в нижнюю часть трубки, которая затем переносят в чистую и маркированы 0,5 мл флакон.
- Следующие 30 мкл 0,1% (объем / объем) Муравьиная кислота в 50% ацетонитрила был добавлен в гель части, чтобы они были только покрыты последующим вортексе два раза в течение 10-15 минут, разделенных кратким центрифугирования. Этот шаг повторяют еще раз, заменив муравьиная кислота-ацетонитрил между шагами.
- Окончательный жидкость удаляется и все экстракционного раствора, объединенных в одном флаконе. Этот объем был сокращен до ~ 30 мкл в speedvac. Образец был готов к обращенной фазой нано-жидкостной хроматографии и идентификации белков масс-спектрометрии. В этом конкретном примере, этот шаг осуществляется на Orbi-ловушки тандемной масс-спектрометр с ThermoFisher (выбрано из-за высокой точностью массы, быстрый цикл для детекции белков и, как правило надежной операционной функции), хотя и другие модели и инструменты производителей может легко использоваться в сочетании с подходом, описанным в этой точке.
- Детали и критерии для масс-спектрометрического анализа теперь кратко представил. Все пептиды были разделены обратной фазы нано-LC (Eksigent) и пептиды были погружены на C18 с обратной фазой столба при расходе 3 мкл / мин. Подвижная фаза составила 0,1% муравьиной кислоты и 2% ACN в воде; мобильной В-фазе составляет 0,1% муравьиной кислоты и 20% воды в Сети. Пептиды вымывают из колонки при расходе 220 л / мин с использованием линейного градиента от 5% В до 50% В в течение 90 мин, затем до 95% В в течение 5 минут, и, наконец, поддержания постоянной 95% В в течение 5 мин . Спектры были приобретены в данных зависит от режима с Orbi-ловушки используются для сканирования MS и LTQ для MS / MS сканирования. Пептиды были найдены при поиске спектров в базе данных крысы IPI v.3.53 использованием SEQUEST алгоритм интегрирован в пакет программного обеспечения Bioworks. Каждый пептид отвечали следующим критериям: XCorr ≥ 2 (+1), ≥ 3 (+2), ≥ 4 (+3), и DeltaCN> 0,1. Все спектры используются для идентификации белков были вручную проверены и не белки принято, когда менее чем за два пептиды были идентифицированы. Только белки, присутствующие после каждой из четырех P2X2 падения тянуть и присутствовать на GST-нуль падения тянуть были рассмотрены для дальнейшего анализа.
Рисунок 1. Схематическое изображение P2X2 рецепторов субъединицы. А. мультфильм показывает топологию P2X2 рецепторов субъединицы. Цитозольного домена состоит из N и C концах. С-конце P2X2 рецепторов (красный) был использован в качестве приманки для выпадающего анализа. B. Аминокислотная последовательность P2X2 рецепторов С-конца, используемые в данном исследовании.
Рисунок 2. Блок-схема и временная диаграмма протокол, используемый для выражения, очищения, потяните вниз и идентификации белков. Мы покажем, контур протокола с тайм-линии. Взрослый мозга крысы лизат приготовить свежую непосредственно перед использованием для выпадающего анализов.
Рисунок 3. Схематическое изображение двоичного протеомных анализ P2X2 С-конца сети в головном мозге крыс. С-конце P2X2 рецепторов сливается с GST белок связан с GST бисером была использована для выпадающего анализов. Мозг лизат был подготовлен и белков инкубировали с иммобилизованным рекомбинантных белков. Свободные фракции промывают лизис буфера. Белки были определены методом масс-спектрометрии.
Рисунок 4. Определение обязательных партнеров С-конце P2X2 рецепторов. Sypro окрашенный гель показывает спектр предполагаемых белков, которые взаимодействуют с С-конца рецепторов сливается с GST (синее поле). Управление полос для GST в одиночку (желтое поле) и глутатион-сефарозе бисером сами по себе также показано на рисунке. Стрелками показаны примеры уникальной группы, которые были вырезаны для дальнейшего анализа методом масс-спектрометрии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ионные каналы являются одной из основных класса интегральных мембранных белков. Они содержат заполненных водой поры, избирательно разрешить перемещение ионов вниз их электрохимического градиента через плазматическую мембрану. Ионные каналы ворота между открытым и закрытым состояниями. Стробирования шаг вызван передатчиков (например, АТФ) в случае Р2Х лиганд ионные каналы, или она может регулироваться взаимодействие с другими белками. Последнее десятилетие наблюдался рост в нашем понимании того, как Р2Х рецепторов связывать АТФ 13, но роль вспомогательных белков в регуляции Р2Х функция остается менее понятны. Подхода, описанного в этом протоколе предназначена для определения сигнализации комплексов, образуемых P2X2 рецепторов путем изучения (в качестве первого шага) белки, взаимодействующие с внутриклеточными C-конца. Полная карта P2X2 рецепторов сигнализации комплекса обеспечит столь необходимый понимание патофизиологии этих очаровательных каналов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
SW и ВТМ поддерживаются NCRR и NHLBI в Национальном институте здравоохранения. БСК и HS поддерживает NINDS и NIGMS Национального института здоровья.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Reagent | JT Baker | 9829-02 | |
| Acrylamide | Reagent | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Ampicillin | Reagent | VWR international | VW1507-01 | |
| Ammonium Bicarbonate | Reagent | Fluka | 09830 | |
| Ammonium Persulphate (APS) | Reagent | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) | Reagent | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Bradford reagent | Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | B-392 | |
| Commassie blue R-250 | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24972 | |
| Dithiotritol (DTT) | Reagent | EMD Millipore | 3860 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Reagent | VWR international | VW1474-01 | |
| Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Formic acid | Reagent | EMD Millipore | 11670-1 | |
| Glutathione Sepharose 4B beads | Reagent | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Reagent | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Reagent | Sigma-Aldrich | 15502 | |
| Iodoacetamide | Reagent | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Luria-Bertani (LB) Media | Reagent | EMD Millipore | 1.00547.5007 | |
| Leupeptin | Reagent | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Magnesium Sulphate (MgSO4) | Reagent | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Reagent | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Flouride (NaF) | Reagent | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Reagent | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Nonidet P40 | Reagent | Fluka | 74385 | |
| Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) | Reagent | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Protease inhibitor tablet | Reagent | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Protein standard | Reagent | Bio-Rad | 161-0305 | |
| Sarkosyl | Reagent | Acros Organics | 61207 | |
| Screw top vial | Tool | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| SYPRO® Ruby protein gel stain | Reagent | Bio-Rad | 170-3125 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Reagent | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Reagent | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trypsin | Reagent | Promega Corp. | V5111 | |
| Tween 20 | Reagent | Sigma-Aldrich | P5927 | |
| Water | Reagent | Burdick & Jackson | 365-4 | |
| LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer | Tool | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Nano Liquid Chromatography System | Tool | Eksigent | ||
| B-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Glycerol | EMD Millipore | GX0185-6 |
References
- Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , 3rd edition, Sinauer Associates Inc. Sunderland Massachusetts, USA. (2001).
- Khakh, B. S. Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses. Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).
- Egan, T. M., Khakh, B. S. Contribution of calcium ions to P2X channel responses. J Neurosci. 24, 3413-3420 (2004).
- Burnashev, N. Calcium permeability of ligand-gated channels. Cell Calcium. 24, 325-332 (1998).
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
- Levitan, I. B. Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels. Nat Neurosci. 9, 305-310 (2006).
- Khakh, B. S., North, R. A. P2X receptors as cell-surface ATP sensors in health and disease. Nature. 442, 527-532 (2006).
- Roger, S., Pelegrin, P., Surprenant, A. Facilitation of P2X7 receptor currents and membrane blebbing via constitutive and dynamic calmodulin binding. J Neurosci. 28, 6393-6401 (2008).
- North, R. A. Molecular physiology of P2X receptors. Physiol Rev. 82, 1013-1067 (2002).
- Khakh, B. S. International union of pharmacology. XXIV. Current status of the nomenclature and properties of P2X receptors and their subunits. Pharmacol Rev. 53, 107-118 (2001).
- Young, M. T. Molecular shape, architecture and size of P2X4 receptors determined using fluorescence resonance energy transfer and electron microscopy. J Biol Chem. 283, 26241-26251 (2008).
- Edmondson, R. D. Protein kinase C epsilon signaling complexes include metabolism- and transcription/translation-related proteins: complimentary separation techniques with LC/MS/MS. Mol Cell Proteomics. 1, 421-433 (2002).
- Evans, R. J. Orthosteric and allosteric binding sites of P2X receptors. Eur Biophys J. 38, 319-327 (2009).
