Summary
हम करने के लिए मस्तिष्क प्रोटीन है कि एटीपी gated P2X2 रिसेप्टर्स की पूरी लंबाई सी टर्मिनस करने के लिए बाध्य की पहचान के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन. एक्सटेंशन और सभी P2X रिसेप्टर्स करने के लिए इस दृष्टिकोण के व्यवस्थित आवेदन P2X रिसेप्टर संकेतन का एक बेहतर समझ के लिए नेतृत्व की उम्मीद है.
Protocol
प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं
प्रयोगात्मक प्रक्रिया (चित्र 2) चार भागों है कि एक कदम बुद्धिमान तरीके में नीचे वर्णित हैं के होते हैं.
भाग 1: और P2X2 रिसेप्टर्स की सी टर्मिनस के Subcloning अभिव्यक्ति.
हम पूरी लंबाई बैक्टीरिया में P2X2 रिसेप्टर्स की C-टर्मिनस मस्तिष्क प्रोटीन जो यह बांध की पहचान व्यक्त की है.
- P2X2 रिसेप्टर (चित्र 1) के सी टर्मिनस पीसीआर (अवशेषों 353-472) से परिलक्षित किया गया था, pGEX 4NT1 (जीई लाइफ साइंसेज) में क्लोन और अनुक्रमण के साथ सत्यापित.
- रीकॉम्बीनैंट प्लाज्मिड ई. में तब्दील किया गया था पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए कोलि (BL21) .
- बैक्टीरिया (ई. कोलाई BL21) P2X2 CT-जीएसटी प्लाज्मिड युक्त ग्लिसरॉल शेयरों एक बाँझ विंदुक टिप के साथ scraped थे और उपयुक्त चयनात्मक मार्कर (50 ग्राम / मिलीलीटर एम्पीसिलीन) और के साथ (पौंड) Luria Bertani मीडिया के 5 मिलीलीटर में inoculated एक कक्षीय प्रकार के बरतन में रात भर 37C पर incubated.
- रात भर बड़े हो संस्कृतियों लेग मीडिया की 250 मिलीलीटर में एक उपयुक्त एंटीबायोटिक (50 μg / मिलीलीटर एम्पीसिलीन) के साथ inoculated थे और जब तक 2-3 घंटे के लिए 250 rpm पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन में 37C में incubated 600 एनएम ऑप्टिकल घनत्व पहुँच ~~ 0.6-0.7.
- संस्कृति IPTG के 1 मिमी के साथ प्रेरित किया गया था और आगे प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए 3 बजे के लिए 37C में incubated.
- संस्कृति तो 4C (1ml संस्कृति की अभिव्यक्ति के स्तर का विश्लेषण करने के लिए सहेजा गया और 'प्रेरित' के रूप में लेबल) पर 15 मिनट के लिए 5000 ग्राम में घूमती है. सतह पर तैरनेवाला खारिज कर दिया गया था और गोली (Ste) Tris EDTA खारा बफर (10 Tris - एचसीएल मिमी, 150 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA 8.0 पीएच) के 20 मिलीलीटर में resuspended किया गया था.
- निलंबन 5000 ग्राम में एक 50 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब में 15 मिनट के लिए काता था. सतह पर तैरनेवाला खारिज कर दिया था और अर्ध - शुष्क गोली में-70C रातोंरात जम गया था.
- -70C गोली बर्फ ठंड lysis बफर (2% (w / v) sarkosyl, 15 मिलीग्राम lysozyme, 150 मिमी NaCl, 50 Tris pH7.5 मिमी, 5 मिमी डीटीटी और पूरा protease अवरोध करनेवाला गोली) के 40 मिलीलीटर में resuspended था , निलंबन और 30 मिनट के लिए बर्फ पर incubated किया गया था. इस ऊष्मायन के दौरान, 3 मिलीलीटर Glutathione Sepharose 4B मोती फास्फेट बफर (पीबीएस) खारा और 20 मिलीलीटर (0.1% (v / v) पीबीएस में tritonX 100) टी पीबीएस PBS द्वारा पीछा के 20 मिलीलीटर के साथ धोया गया. मोती 1 मिलीलीटर पीबीएस में resuspended थे.
- जीवाणु निलंबन था तरल नाइट्रोजन में 3 बार फ्रीज thawed और sonicated (1s पर / बंद, बर्फ पर 3 मिनट के लिए 30 microns) और आगे 4% के साथ 30 मिनट (v / v) Triton एक्स 100, 10 मिमी MgSO के लिए incubated 4 और बर्फ पर 2 मिमी एटीपी.
- lysate 20000 छ 4C और गोली में 15 मिनट के लिए काता था त्याग (गोली और सतह पर तैरनेवाला के 1 मिलीलीटर एसडीएस पृष्ठ के लिए बचाया था cytosol और झिल्ली में प्रोटीन की मात्रा का परीक्षण से एक नमूना). सतह पर तैरनेवाला 1 (या रात) घंटा 4C पर मोती के साथ incubated था.
- मोती 500 ग्राम में 5 मिनट के लिए काता थे और सतह पर तैरनेवाला (नमूना अनबाउंड अंश के लिए बचाया था) खारिज कर दिया था. मोती टी पीबीएस पांच बार (washes धोने नियंत्रण के लिए बच गए) के साथ धोया गया.
- मोती पीबीएस में तो resuspended 50% (w / v) घोल दे और उपयोग करें जब तक 4C पर फ्रिज में संग्रहीत. प्रोटीन एकाग्रता ब्रैडफोर्ड परख (निर्माता के निर्देशों के अनुसार) के द्वारा अनुमान लगाया गया था.
भाग 2: पूरे मस्तिष्क lysates की तैयारी
P2X2 रिसेप्टर्स करने के लिए बहुतायत से 8 मस्तिष्क में व्यक्त किया जा के लिए जाना जाता है. वर्तमान विश्लेषण में, हम चूहे पूरे मस्तिष्क lysates (चित्र 3) से P2X2 रिसेप्टर्स के साथ बातचीत प्रोटीन की पहचान की मांग की.
- वयस्क चूहे मस्तिष्क (जानवरों एक UCLA IAACUC अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार और प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए NIH गाइड अनुसार बलिदान थे) काटा गया था और तुरंत बर्फ के ठंडे पीबीएस (3X) rinsed.
- बर्फ ठंड lysis 150 मिमी युक्त बफर के 10 मिलीलीटर (~ 5 बार काटा मस्तिष्क के गीला वजन) NaCl, 50 मिमी Tris - एचसीएल, 7.4 पीएच, 10 मिमी EDTA, 1 मिमी EGTA, 1 मिमी NAF, 1 मिमी कोशिकाओं lyse ना 3 4 VO, 1 मिमी PMSF, 5 μg / leupeptin के मिलीलीटर, 1 (v / v) एनपी 40%, और एक protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल गोली काटा मस्तिष्क को जोड़ा गया है.
- मस्तिष्क के ऊतकों की एक गिलास Dounce homogenizer के साथ बर्फ पर homogenised सजातीय निरंतरता का एक मिश्रण जब तक हासिल की थी.
- सेल lysate 5 मिनट के लिए 2000 ग्राम में काता था अटूट कोशिकाओं को हटाने. सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था और काता फिर 60 मिनट के लिए 29000 जी बरकरार organelles और झिल्ली समुच्चय को हटाने.
- सतह पर तैरनेवाला centrifugation के तुरंत बाद एक स्वच्छ ट्यूब को हस्तांतरित किया गया. पूरे मस्तिष्क lysate के प्रोटीन एकाग्रता ब्रैडफोर्ड परख द्वारा मापा गया था (आमतौर पर ~ 15 मिलीग्राम / एमएल).
- lysate aliquoted और पर-70C संग्रहीत किया गया था.
भाग 3: P2X2 सी पूंछ जुड़े प्रोटीन का अलगाव
पूरे दिमाग lysates से P2X2 सीटी - जीएसटी के बंधन भागीदारों की पहचान करने के लिए, परख नीचे खींच CT जी का उपयोग करके प्रदर्शन किया गया थाअनुसूचित जनजाति के चारे के रूप में glutathione sepharose 4B मनकों पर स्थिर है. नियंत्रण के लिए, अकेले जीएसटी मोतियों के लिए बाध्य इस्तेमाल किया गया था.
- ब्रेन lysate 4C पर 1 घंटे के लिए जीएसटी मोतियों के साथ precleared था. गोली त्याग और सतह पर तैरनेवाला आगे के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था.
- GST और (10 μg) सीटी जीएसटी P2X2 glutathione sepharose 4 बी मोती के लिए बाध्य के समान मात्रा में रात भर चूहे पूरे मस्तिष्क lysate से precleared solubilised प्रोटीन की 100 ग्राम के साथ lysis बफर में 4C पर रोटेशन के साथ incubated रहे थे.
- मोती 5 मिनट के लिए 1000 ग्राम में काता थे और सतह पर तैरनेवाला खारिज कर दिया था.
- मोती एक बार lysis बफर के साथ धोया गया है और संशोधित Laemli बफर में उबला हुआ [4% (w / v) एसडीएस, 10% (v / v) 2-mercaptoethanol, 2% (v / v) ग्लिसरॉल, 0.004% (w / v) bromophenol नीले और 0.125 एम TrisCl 6.8 5 मिनट के लिए] पीएच.
- नमूने 5000 जी पर 5 मिनट और 10% एसडीएस PAGE (चित्र 4) द्वारा अलग सतह पर तैरनेवाला के लिए काता थे. जैल SYPRO रूबी प्रोटीन दाग जेल (निर्माता के निर्देशों के अनुसार) और पराबैंगनी प्रकाश के तहत कल्पना के साथ दाग रहे थे. P2X2 सीटी जुड़े प्रोटीन बरामद उन चारे के रूप में जीएसटी बातिल का उपयोग कर के साथ तुलना में थे. चार जैविक थे प्रदर्शन (यानी चार दिमाग और चार स्वतंत्र खींच चढ़ाव) replicates.
भाग 4: प्रोटीन की पहचान.
जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग प्रोटीन जेल से excised थे और मास स्पेक्ट्रोमेट्री 12 के द्वारा की पहचान नोट: प्रक्रिया के दौरान धूल के अभाव केरातिन संदूषण को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. experimenter एक चेहरा मुखौटा पहन, बाल शुद्ध और दस्ताने चाहिए और हर समय दस्ताने के उपयोग के बिना ब्याज की जेल क्षेत्र कभी नहीं स्पर्श.
- सभी दिखाई प्रोटीन नीचे खींच P2X2 से बरामद बैंड एक साफ रेजर ब्लेड के साथ excised थे और diced (चित्र 4). जीएसटी - अशक्त में जेल की इसी क्षेत्रों लेन नीचे खींच भी बैंड धुंधला (जीएसटी - अशक्त चारा के लिए विशिष्ट बैंड भी excised थे और पहचान) के संबंध के स्तर से नीचे है कि प्रोटीन की उपस्थिति बीमा के बिना एक ही तरीके से excised धुंधला संवेदनशीलता याद नहीं था.
- जेल टुकड़े 50 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट के 50% में 200 μl (v / v) acetonitrile (ACN) और आरटी पर 15 मिनट के लिए vortexed ट्यूबों के साथ incubated रहे थे. इस धोने कदम दोहराएँ.
- जेल टुकड़े 200 μl acetonitrile (जेल टुकड़े छोटा और रंग में अपारदर्शी हो जाना चाहिए) जोड़कर निर्जलित थे.
- Acetontrile हटा दिया गया था और जेल टुकड़े ~ 10 मिनट के लिए एक speedvac में सूखे.
- जेल टुकड़े तो हौसले से तैयार 10 मिमी DTT/10 मिमी (2 carboxy - एथिल) पर्याप्त मात्रा के phosphine हाइड्रोक्लोराइड (TCEP) Tris 30 μl के साथ incubated रहे थे टुकड़े को विसर्जित करने के लिए. यह 56C पानी के स्नान पर 30 मिनट के लिए छोड़ दिया गया था.
- अगला डीटीटी समाधान 100 μl 50% acetonitrile समाधान में 500 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट और जेल ammounium बिकारबोनिट के साथ धोया स्लाइस के साथ बदल दिया गया था.
- धोने के समाधान से aspirated था और acetonitrile के 200 μl जैल निर्जलीकरण जोड़ी.
- Acetonitrile और फिर हटा दिया गया था 100 μl हौसले से तैयार 100 मिमी iodoacetamide समाधान के लिए मुफ्त sulfhydryls alkylate जोड़ा गया है. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 25 मिनट के लिए यह कदम दीं.
- Iodoacetamide समाधान निकाल गया था और जेल के टुकड़े 2 मिनट के लिए 50% (8.0 पीएच) acetontrile में 50 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट के 200 μl से धोया गया जबकि vortexing. यह धोने कदम दोहराया गया था.
- धोने समाधान को हटाने के बाद, जेल टुकड़े 200 μl acetonitrile जो तब ~ 10min के लिए speedvac द्वारा हटा दिया गया था के साथ incubated रहे थे.
- इस चरण में जेल टुकड़े trypsin पाचन के लिए तैयार हैं. जेल टुकड़े 30 μl trypsin समाधान (20 / एनजी μL काम एकाग्रता) में incubated रहे थे और अच्छी तरह से सूजन हो जैल के लिए 10 मिनट के लिए बर्फ पर रखा है. अतिरिक्त trypsin हटाया गया था और जेल 50 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट के साथ 30 μl के साथ रखने के लिए उन्हें पाचन जो 37C पर 12 से 16 घंटे के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दी गई थी भर में डूबे मढ़ा कणों rehydrated.
- 5% की पांच μl (v / v) चींटी एसिड trypsin और गिरफ्तारी पाचन निष्क्रिय करने के लिए जोड़ा जाता है.
- ट्यूबों ~ 15 मिनट के लिए vortexed थे और संक्षेप में जो फिर एक स्वच्छ और लेबल 0.5 मिलीलीटर शीशी को हस्तांतरित किया गया ट्यूब के नीचे करने के लिए तरल लाने centrifuged.
- अगले 0.1% की 30 μl (v / v) 50% acetonitrile में चींटी एसिड जेल टुकड़े करने के लिए जोड़ा गया है ताकि वे सिर्फ 10-15 मिनट के लिए दो बार vortexing संक्षिप्त centrifugation द्वारा अलग से बाद कवर थे. यह कदम एक बार दोहराया गया था, कदम के बीच चींटी एसिड acetonitrile जगह.
- अंतिम तरल हटा दिया था और एक एक शीशी में सभी निकासी समाधान संयुक्त. यह मात्रा ~ speedvac में 30 उल कम हो गया था. नमूना था अब रिवर्स चरण नैनो तरल क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटीन की पहचान के लिए तैयार है. इस विशिष्ट उदाहरण में, इस कदम से बाहर ThermoF से एक Orbi जाल अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमीटर पर किया जाता है(अपने उच्च जन सटीकता, प्रोटीन का पता लगाने के लिए तेजी से कर्तव्य चक्र और आम तौर पर मजबूत ऑपरेटिंग सुविधाओं के लिए चुना) isher, हालांकि अन्य मॉडल और निर्माताओं उपकरणों को आसानी से इस बिंदु वर्णित दृष्टिकोण के साथ युग्मित किया जा सकता है है.
- विवरण और बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण के लिए मापदंड अब संक्षेप में प्रस्तुत कर रहे हैं. सभी पेप्टाइड्स रिवर्स चरण नैनो नियंत्रण रेखा (Eksigent) और पेप्टाइड्स C18 रिवर्स चरण स्तंभ पर μl 3 / मिनट की एक प्रवाह दर पर लोड किए गए थे द्वारा अलग किया गया. मोबाइल चरण एक 0.1% चींटी एसिड और पानी में 2% की ACN था, मोबाइल चरण बी 0.1% चींटी एसिड और ACN में 20% पानी था. पेप्टाइड्स 220 nl / मिनट 5% बी से एक रेखीय ढाल का उपयोग कर 90 मिनट से अधिक 50% बी, फिर 5 मिनट से अधिक 95% बी के एक प्रवाह दर पर स्तंभ से eluted थे, और अंत में 5 मिनट के लिए लगातार 95% बी रखते हुए . स्पेक्ट्रा डेटा पर निर्भर मोड में एमएस एमएस / एमएस स्कैन के लिए और स्कैन LTQ के लिए इस्तेमाल किया Orbi जाल के साथ हासिल किया गया. पेप्टाइड्स चूहे आईपीआई v.3.53 डेटाबेस SEQUEST Bioworks सॉफ्टवेयर पैकेज में एकीकृत एल्गोरिथ्म का उपयोग कर के खिलाफ स्पेक्ट्रा खोज द्वारा की पहचान की गई. प्रत्येक पेप्टाइड निम्नलिखित मानदंडों से मुलाकात: XCorr ≥ 2 (1), 3 ≥ (2), 4 ≥ (3), और 0.1> DeltaCN. सभी प्रोटीन की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता स्पेक्ट्रा स्वयं निरीक्षण किया गया और कोई प्रोटीन स्वीकार किए जाते हैं जब कम से कम दो पेप्टाइड्स पहचान थे. केवल प्रोटीन चार P2X2 खींच चढ़ाव के प्रत्येक और जीएसटी अशक्त खींच चढ़ाव के दौरान अनुपस्थित निम्नलिखित उपस्थित आगे के विश्लेषण के लिए विचार किया गया.
चित्रा 1. एक P2X2 रिसेप्टर सबयूनिट की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. ए कार्टून एक P2X2 रिसेप्टर सबयूनिट के टोपोलॉजी दिखाता है. साइटोसोलिक डोमेन और एन सी Termini के होते हैं. P2X2 रिसेप्टर (लाल) के सी टर्मिनस परख नीचे खींचने के लिए प्रलोभन के रूप में इस्तेमाल किया गया था बी P2X2 रिसेप्टर सी टर्मिनस इस अध्ययन में इस्तेमाल के एमिनो एसिड अनुक्रम .
चित्रा 2. फ्लो चार्ट और अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल के समय रेखा, शुद्धि, नीचे खींच और प्रोटीन की पहचान हम समय रेखा के साथ प्रोटोकॉल की रूपरेखा दिखा . वयस्क चूहे मस्तिष्क lysate assays के नीचे खींच के लिए उपयोग करने से पहले तुरंत ताजा तैयार किया गया था.
चित्रा 3. P2X2 चूहा मस्तिष्क में सी टर्मिनस नेटवर्क के द्विआधारी प्रोटिओमिक विश्लेषण की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. P2X2 जीएसटी जीएसटी मोती के लिए बाध्य प्रोटीन के साथ जुड़े हुए रिसेप्टर्स की सी टर्मिनस नीचे assays खींचने के लिए इस्तेमाल किया गया था . ब्रेन lysate तैयार किया गया था और प्रोटीन immobilized पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ incubated रहे थे. अनबाउंड अंश lysis बफर के साथ धोया था. प्रोटीन मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा की पहचान की गई.
चित्रा 4 P2X2 रिसेप्टर्स की सी टर्मिनस के बंधन भागीदारों की पहचान Sypro दाग जेल ख्यात प्रोटीन है कि जीएसटी (नीला बॉक्स) के साथ जुड़े हुए रिसेप्टर्स की सी टर्मिनस के साथ बातचीत का एक स्पेक्ट्रम दिखा . जीएसटी (पीला बॉक्स) अकेले और glutathione sepharose मोती अकेले के लिए नियंत्रण की गलियों में भी दिखाए जाते हैं. तीर अद्वितीय बैंड है कि आगे के विश्लेषण के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री के द्वारा excised थे के उदाहरण से संकेत मिलता है.
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Discussion
आयन चैनलों अभिन्न झिल्ली प्रोटीन का एक प्रमुख वर्ग हैं. वे पानी भरा pores कि चुनिंदा उनके विद्युत gradients के नीचे आयनों के प्लाज्मा झिल्ली भर में आंदोलन की अनुमति होते हैं. आयन चैनल गेट खुला और बंद राज्यों के बीच. gating कदम P2X ligand gated आयन चैनलों के मामले में ट्रांसमीटरों (जैसे एटीपी) के द्वारा ट्रिगर है, या यह अन्य प्रोटीन के साथ बातचीत के द्वारा विनियमित किया जा सकता है. पिछले दशक कैसे P2X रिसेप्टर्स 13 एटीपी बाँध के बारे में हमारी समझ में वृद्धि देखी गई है, लेकिन P2X समारोह को विनियमित करने में सहायक प्रोटीन की भूमिका कम अच्छी तरह से समझ बनी हुई है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित दृष्टिकोण करने के लिए संकेत (एक पहला कदम के रूप में) intracellular सी टर्मिनस साथ बातचीत प्रोटीन की जांच करके P2X2 रिसेप्टर्स द्वारा गठित परिसरों की पहचान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है. P2X2 रिसेप्टर संकेत जटिल की एक पूरी नक्शा इन आकर्षक चैनलों के pathophysiology में बहुत आवश्यक अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा.
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Acknowledgments
दप और TMV NCRR और NHLBI द्वारा स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान में समर्थित हैं. BSK और एचएस NINDS और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के NIGMS द्वारा समर्थित हैं.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Reagent | JT Baker | 9829-02 | |
| Acrylamide | Reagent | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Ampicillin | Reagent | VWR international | VW1507-01 | |
| Ammonium Bicarbonate | Reagent | Fluka | 09830 | |
| Ammonium Persulphate (APS) | Reagent | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) | Reagent | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Bradford reagent | Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | B-392 | |
| Commassie blue R-250 | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24972 | |
| Dithiotritol (DTT) | Reagent | EMD Millipore | 3860 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Reagent | VWR international | VW1474-01 | |
| Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Formic acid | Reagent | EMD Millipore | 11670-1 | |
| Glutathione Sepharose 4B beads | Reagent | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Reagent | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Reagent | Sigma-Aldrich | 15502 | |
| Iodoacetamide | Reagent | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Luria-Bertani (LB) Media | Reagent | EMD Millipore | 1.00547.5007 | |
| Leupeptin | Reagent | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Magnesium Sulphate (MgSO4) | Reagent | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Reagent | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Flouride (NaF) | Reagent | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Reagent | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Nonidet P40 | Reagent | Fluka | 74385 | |
| Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) | Reagent | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Protease inhibitor tablet | Reagent | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Protein standard | Reagent | Bio-Rad | 161-0305 | |
| Sarkosyl | Reagent | Acros Organics | 61207 | |
| Screw top vial | Tool | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| SYPRO® Ruby protein gel stain | Reagent | Bio-Rad | 170-3125 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Reagent | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Reagent | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trypsin | Reagent | Promega Corp. | V5111 | |
| Tween 20 | Reagent | Sigma-Aldrich | P5927 | |
| Water | Reagent | Burdick & Jackson | 365-4 | |
| LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer | Tool | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Nano Liquid Chromatography System | Tool | Eksigent | ||
| B-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Glycerol | EMD Millipore | GX0185-6 |
References
- Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , 3rd edition, Sinauer Associates Inc. Sunderland Massachusetts, USA. (2001).
- Khakh, B. S. Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses. Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).
- Egan, T. M., Khakh, B. S. Contribution of calcium ions to P2X channel responses. J Neurosci. 24, 3413-3420 (2004).
- Burnashev, N. Calcium permeability of ligand-gated channels. Cell Calcium. 24, 325-332 (1998).
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
- Levitan, I. B. Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels. Nat Neurosci. 9, 305-310 (2006).
- Khakh, B. S., North, R. A. P2X receptors as cell-surface ATP sensors in health and disease. Nature. 442, 527-532 (2006).
- Roger, S., Pelegrin, P., Surprenant, A. Facilitation of P2X7 receptor currents and membrane blebbing via constitutive and dynamic calmodulin binding. J Neurosci. 28, 6393-6401 (2008).
- North, R. A. Molecular physiology of P2X receptors. Physiol Rev. 82, 1013-1067 (2002).
- Khakh, B. S. International union of pharmacology. XXIV. Current status of the nomenclature and properties of P2X receptors and their subunits. Pharmacol Rev. 53, 107-118 (2001).
- Young, M. T. Molecular shape, architecture and size of P2X4 receptors determined using fluorescence resonance energy transfer and electron microscopy. J Biol Chem. 283, 26241-26251 (2008).
- Edmondson, R. D. Protein kinase C epsilon signaling complexes include metabolism- and transcription/translation-related proteins: complimentary separation techniques with LC/MS/MS. Mol Cell Proteomics. 1, 421-433 (2002).
- Evans, R. J. Orthosteric and allosteric binding sites of P2X receptors. Eur Biophys J. 38, 319-327 (2009).
