Mesure exocytose dans les neurones en utilisant un étiquetage FM
Summary
La capacité de mesurer la cinétique de libération des vésicules peut aider à fournir un aperçu de certaines des bases de la neurotransmission. Ici nous avons utilisé l'imagerie en temps réel des vésicules étiquetés avec le rouge FM colorant fluorescent 4-64 pour mesurer le taux de libération des vésicules présynaptiques dans les cultures de neurones hippocampiques.
Abstract
La capacité de mesurer la cinétique de libération des vésicules peut aider à fournir un aperçu de certaines des bases de la neurotransmission. Ici nous avons utilisé l'imagerie en temps réel des vésicules étiquetés avec FM colorant pour surveiller le taux de libération des vésicules présynaptiques. FM4-64 est un colorant fluorescent rouge amphiphiles styryle qui embarque dans les membranes des vésicules synaptiques que l'endocytose est stimulée. Interactions lipophiles provoquer la teinture d'augmenter fortement la fluorescence, émettant ainsi un signal lumineux lorsqu'ils sont associés à des vésicules et un nominal quand dans le liquide extracellulaire. Après une étape de lavage est utilisée pour aider à enlever le colorant externes au sein de la membrane plasmique, le reste FM est concentrée dans les vésicules et est ensuite expulsé lors exocytose induite par un autre tour de la stimulation électrique. Le taux de libération de vésicules est mesurée par la diminution résultant de la fluorescence. Depuis FM colorant peut être appliqué externe et transitoire, il est un outil utile pour déterminer les taux de l'exocytose dans les cultures de neurones, surtout quand on compare les taux entre les synapses et les boutons de contrôle transfectées voisins.
Protocol
Discussion
Comme 300 des potentiels d'action (AP) est suffisante pour induire au moins un tour de recyclage des vésicules, une relance de chargement de 300 points d'accès ou plus est souvent donnée à l'étiquette de la piscine de recyclage des vésicules. Bien que les stimuli de chargement plus intenses, tels que 900 points d'accès, peut permettre à un nombre nominal de vésicules supplémentaire à être étiquetés, ce qui augmente également la quantité de temps, le colorant peut intégrer dans les membranes extracellulaires,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| APV | Sigma | A5282 | ||
| FM 4-64 | Molecular Probes | T-3166 | ||
| CNQX disodium salt | Sigma | C-239 |
References
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
