La medición de la exocitosis en las neuronas de un etiquetado FM
Summary
La capacidad de medir la cinética de liberación de vesículas puede ayudar a dar una idea de algunos de los fundamentos de la neurotransmisión. Aquí hemos utilizado imágenes en tiempo real de las vesículas marcadas con el tinte rojo fluorescente FM 4-64 para medir la velocidad de liberación de la vesícula presináptica en cultivos neuronales del hipocampo.
Abstract
La capacidad de medir la cinética de liberación de vesículas puede ayudar a dar una idea de algunos de los fundamentos de la neurotransmisión. Aquí hemos utilizado imágenes en tiempo real de las vesículas marcadas con FM tinte para controlar la velocidad de liberación de la vesícula presináptica. FM4-64 es un colorante fluorescente rojo anfifílicas estirilo que incrusta en la membrana de las vesículas sinápticas que se estimula la endocitosis. Interacciones lipofílicas hacer que el medio de contraste para aumentar en gran medida de la fluorescencia, por lo que emite una señal luminosa cuando se asocia con vesículas y uno nominal, cuando en el líquido extracelular. Después de una etapa de lavado se utiliza para ayudar a quitar el tinte externa dentro de la membrana plasmática, el resto de FM se concentra dentro de las vesículas y luego es expulsado cuando exocitosis es inducida por una nueva ronda de la estimulación eléctrica. La velocidad de liberación de las vesículas se mide desde la consiguiente disminución de la fluorescencia. Desde FM tinte se puede aplicar de forma transitoria y externa, es una herramienta útil para determinar las tasas de exocitosis en cultivos neuronales, especialmente cuando se comparan las tasas entre las sinapsis y transfectadas boutons vecinos de control.
Protocol
Discussion
De 300 potenciales de acción (AP) es suficiente para inducir al menos una ronda de reciclaje de vesículas, un estímulo de carga de 300 puntos de acceso o más a menudo se da a la etiqueta de la piscina de reciclaje de vesículas. A pesar de los estímulos de carga más intensa, como 900 puntos de acceso, puede permitir que un número nominal de vesículas adicionales etiquetados, esto también aumenta la cantidad de tiempo que el tinte se puede integrar en las membranas extracelulares, lo que lleva a una mayor tinción no específica. He…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| APV | Sigma | A5282 | ||
| FM 4-64 | Molecular Probes | T-3166 | ||
| CNQX disodium salt | Sigma | C-239 |
References
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
