Mätning exocytos i de nervceller Använda FM-märkning

Summary

Förmågan att mäta kinetiken av vesikler utgåva kan bidra till att ge inblick i några av grunderna i neurotransmission. Här har vi använt i realtid avbildning av blåsor märkt med röd fluorescerande färg FM 4-64 för att mäta graden av presynaptiska vesikler release i hippocampus neuronala kulturer.

Abstract

Förmågan att mäta kinetiken av vesikler utgåva kan bidra till att ge inblick i några av grunderna i neurotransmission. Här har vi använt i realtid avbildning av blåsor märkta med FM-färg för att kontrollera graden av presynaptiska vesikler release. FM4-64 är en röd fluorescerande amfifila styryl färg som bäddar in i membranen av synaptiska vesikler som endocytos stimuleras. Lipofila växelverkan orsakar färgen att kraftigt öka i fluorescens och därmed avger en ljus signal när förknippas med blåsor och en nominell en när i den extracellulära vätskan. Efter en tvätt steg används för att ta bort externa färgämnet i plasmamembranet, är den återstående FM koncentrerade inom blåsor och sedan utvisas när exocytos framkallas av en annan runda av elektrisk stimulering. Graden av blåsor släppa mäts från den resulterande minskningen i fluorescens. Eftersom FM färgen kan appliceras yttre och övergående, det är ett användbart verktyg för att bestämma andelen exocytos i neuronala kulturer, särskilt när man jämför priser mellan transfekterade synapser och angränsande boutons kontroll.

Protocol

Celler: Rat (eller mus) primära hippocampus neuronala kulturer (14-28 dagar in vitro). Stimulering: Elektrisk, levereras via två platina elektroder, 70-90 mV Mikroskopi: 60x olja linsen på ett inverterat CCD fluorescerande mikroskop. Programvara: Slidebook (Intelligent Imaging Innovationer, Santa Monica, Kalifornien) Se kompletterande metoder sida för mer information Varm HEPES-sa…

Discussion

Som 300 aktionspotentialer (APS) är tillräcklig för att framkalla åtminstone en runda av vesikler återvinning, en lastning stimulans på 300 accesspunkter eller mer ges ofta för att märka återvinning pool av blåsor. Även om mer intensiv lastning stimuli, såsom 900 accesspunkter, kan möjliggöra en nominell antal ytterligare blåsor som ska märkas, ökar detta också den tid färgen kan bädda in i extracellulärt membran, vilket leder till större icke-specifik färgning. Jag har hittat tvättningen att vara kritisk för att s?…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
APV		Sigma	A5282
FM 4-64		Molecular Probes	T-3166
CNQX disodium salt		Sigma	C-239