Summary
Assay MTT היא assay colorimetric קל לשעתקו להערכת כדאיות התא המבוסס על הפחתה של MTT צהוב וייצור של formazan מסיס במים סגול. כאן, לקיומה של MCF-7 תאים על הטיפול nanogenomedicine הוערך.
Abstract
Cytotoxicity של nanogenomedicine עתידני (למשל, התערבות RNA קצר antisense) עלול לעכב את הפיתוח הקליני שלה. מבין אלה, את התרופה גן מבוססי ו / או הספק שלו עלולים לעורר רעילות הסלולר. להערכת cytotoxicity כאלה, מתודולוגיה נפוצה היא תלויה במידה רבה על ניצול של 3 - (4, 5-dimethyl-2-thiazolyl) -2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium ברומיד (MTT) assay אשר כבר בשימוש נרחב כמו גישה colorimetric מבוסס על פעילות של אנזימים דהידרוגנז המיטוכונדריה בתאים. בחקירה הנוכחית, MCF-7 תאים היו מחוסן בצלחת-96 היטב על 50% confluency הם טופלו nanopolyplexes שונים נתון MTT assay לאחר 24 שעות. MTT מסיס במים צהוב עובר מטבוליזם על ידי תאים פעילים מבחינה מטבולית למים מסיסים סגול formazan, אשר מומס נוספת pH חיץ dimethylsulfoxide ו s Sornson 10.5. המוצר כתוצאה ניתן לכמת ידי לספקטרופוטומטריה באמצעות קורא צלחת ב 570 ננומטר.
Protocol
MCF-7 זריעת בצלחת-96 היטב:
MCF-7 התאים בתרבית 25 t-בקבוק במדיום המכיל בינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM), 10% FBS, 100 U / ml פניצילין, ו -100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין ב 37 ° C עם 5% CO 2, 95% האוויר והלחות להשלים. הגיעה לאחר ~ 90% confluency, הם היו מנותקים באמצעות 0.05% טריפסין / EDTA וספר באמצעות trypan כחול hemocytometer. תאים אלה היו resuspended אז בריכוז של 4 × 4 תאים 10 / 2 ס"מ והוסיף לצלחת 96-היטב (כלומר, 250 μl / טוב) על ידי פיפטה 8 ערוצים. עבור קליטה רקע, בארות חלקם נשארו בתא חינם, כלומר כביקורת ריק.
טיפול בתאי עם nanopolyplexes שונים:
ב 40-50% confluency (48 שעות זריעת פוסט), התאים מעובדים טופלו nanostructured polyamidoamine dendrimers מהספרים (כלומר, Superfect Polyfect ® ו ®) ו פולימר מבחן הרומן בעקבות הוראה transfection שמספק לו הספק. תאים שטופלו גם עם EGFR ו מקושקשות antisense לבד, עם שלוש nanopolyplexes שונים של שני אלה oligonucleotides ועם פולימרים (n = 4). ארבע בארות היו נשאר לא מטופל כמו שליטה. לאחר 4 שעות בתקשורת טיפול הוסרו מתחדש עם מדיה חדשה.
MTT assay להערכת כדאיות התא:
Assay MTT בוצעה 24 שעות לאחר transfection. למטרה זו, הפתרון MTT הוכן 1mg/ml ב PBS והיה מסונן באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר. ואז, 50 μl של MTT בתוספת 200 μl של DMEM ללא פנול אדום נוספו לתוך הבאר כל, מלבד התא ללא בארות ריק. התאים הודגרו במשך 4 שעות ב 37 ° C עם 5% CO 2, 95% אוויר ולחות מוחלטת. לאחר 4 שעות, הפתרון MTT הוסרה והוחלפה 200 μl של DMSO ו גליצין 25μl סורנסון של המאגר (גליצין 0.1M, 0.1M NaCl, pH: 10.5 עם 0.1 NaOH). צלחת הודגר עוד 5 דקות בטמפרטורת החדר, ואת צפיפות אופטית (OD) של בארות נקבע באמצעות קורא צלחת באורך גל של 570 ננומטר הבדיקה ואת אורך גל של 630 ננומטר התייחסות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Assay MTT נחשבת שיטה צדדי ובהתאם את יכולת הקיום של תאים יכול להיות מוערך על טיפולים שונים. הפקת formazan כתוצאה שנראה יחסית ברמה של מטבוליזם האנרגיה בתאים. לכן, ניתן למדוד את התאים מופעל מטבולית גם בהעדר התפשטות תאים. כמות formazan המיוצר הוא יחסי לכמות MTT במדיום הדגירה. אמנם, את הריכוז של MTT אשר נדרש כדי להשיג את הסכום המקסימלי של formazan מיוצר עשוי להשתנות על ניצול של שורות תאים שונות. חוץ מזה, שיש בשימוש זה assay, מספר קטן מאוד של תאים חיים ניתן היה לזהות את השכיחות של טעויות תהיה מינימלית שכן אין צורך לנקוט צעדים כביסה. קליטת formazan משתנה עם מספר תאים, כמו גם ה-pH אשר ניתן להתגבר עם תוספת של חוצץ ב-pH 10.5 1. צבע formazan יציב במשך כמה שעות בטמפרטורת החדר 2. במקרה של הצלחת אחד או יותר, שולטת יש לכלול לוחות אחרים. עם זאת, שיטה זו סובלת כמה חסרונות קטנים: א) תאים פעילים מבחינה מטבולית לא יכול להיות מופלים עם התאים המתים 3, ב) פתרון MTT צריך להיות מוגן מפני אור למרות שזה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס לכל היותר חודש, 2 ג) הוא נכשל כדי לאמת את יציבות התרופה במדיום, ו ד) תאים המשמשים MTT לא ניתן להשתמש בו לאחר מכן עבור כל מבחני אחרות.
זה צריך להיות אדום העלה כי פנול סופג על 570 ננומטר. יתר על כן, זה כבר דיווחו בעבר כי פנול אדום בעל פעילות האסטרוגן, אשר עלול להשפיע על גדילת התאים דפוס בתוך תאים מסוימים מגיבים אסטרוגן, שהתפתח תוצאות MTT מדויק. כדי למנוע השפעה כזו, יש לנו מנוצל DMEM ללא פנול אדום 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר לתאי גזע טכנולוגיה שהיד גאזי חברות טבריז בהתאמה למתן DMEM ללא מים סטריליים פנול אדום להזרקה כמתנות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 t-flask | Orange Scientific | 5510100 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Penicillin 200,000 u/ml | CinnaGen | CR7913 | |
| Streptomycin 200 mg/ml | CinnaGen | CR7912 | |
| trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Superfect | Qiagen | 301105 | |
| Polyfect | Qiagen | 301305 | |
| EGFR antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| Scrambled antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| DMEM without phenol red | GIBCO, by Life Technologies | 11880 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| hemocytometer | HBG | ||
| 8-channel pipette | TreffLab Transferpette | 96.9918.10.1 | |
| Disposable syringe filter | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 2052-025 | |
| Plate reader equipped with 570 nm &630 nm filters | BioTek | ELX808 | |
| 96-well plate with lid (flat bottom) | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 3860-096 | |
| Laminar flow hood | Esco Products | ||
| CO2 Incubator | ASTEC |
References
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH Dependence of 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide-Formazan Absorption on Chemosensitivity Determined by a Novel Tetrazolium-based Assay. Cancer Research. 49, 4435-4435 (1989).
- Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal of Lmmunological Methods. 65, 55-55 (1983).
- Yang, M. Energy and Redox States in the C6 Glioma Cells Following Acute Exposure to Zn, Se +4 , and Se +6 and the Correlation with Apoptosis. Toxicology Mechanisms and Methods. 16 (1), 13-13 (2006).
- Spinner, D. M. MTT Growth Assays in Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer: Methods and Protocols. Bartlett, J. M. S. , Humana Press, Inc. 175-177 (2000).
