Summary
Nous décrivons une DIG modifiés
Abstract
Les technologies à haut débit d'analyse d'expression aujourd'hui disponibles donnent aux scientifiques un débordement de profils d'expression, mais leur résolution en termes d'expression tissu spécifique est limitée à cause de problèmes dans la dissection des tissus individuels. Données d'expression doit être confirmée et complétée par des profils d'expression en utilisant par exemple l'hybridation in situ, une technique utilisée pour localiser les cellules l'expression des ARNm spécifiques. L'hybridation in situ dans la méthode est laborieuse, chronophage et nécessite souvent l'optimisation étendu selon les espèces et les tissus. Dans les expériences in situ sont relativement plus difficiles à réaliser dans les espèces ligneuses telles que l'épinette de conifères Norvège (Picea abies). Nous présentons ici une DIG modifié protocole d'hybridation in situ, ce qui est rapide et applicable sur une large gamme d'espèces de plantes dont P. abies. Avec quelques ajustements, notamment modifié la RNase traitement et la protéinase K de concentration, on peut utiliser le protocole pour étudier l'expression tissu-spécifique des gènes homologues dans les organes reproducteurs mâles d'une gymnosperme et deux espèces d'angiospermes; P. abies, Arabidopsis thaliana et de Brassica napus. Le protocole a travaillé aussi bien pour les espèces et les gènes étudiés. AtAP3 et BnAP3 ont été observées dans les deuxième et troisième verticille organes floraux en A. thaliana et B. napus et DAL13 de microsporophylls des cônes mâles de P. abies. Pour P. abies la concentration protéinase K, utilisé pour permeablize les tissus, a dû être augmenté à 3 g / ml au lieu de 1 g / ml, probablement due à des tissus plus compacts et des niveaux élevés de composés phénoliques et des polysaccharides. Pour toutes les espèces du traitement RNase a été retirée en raison de la force du signal réduit sans une augmentation correspondante de la spécificité. En comparant les modèles de tissu expression spécifique des gènes homologues à partir de plantes fleuries à la fois et d'un conifère, nous démontrons que la DIG dans le protocole in situ présentées ici, avec seulement des ajustements minute, peut être appliquée à un large éventail d'espèces végétales. Ainsi, le protocole évite à la fois l'optimisation des espèces étendues spécifiques et l'utilisation de sondes laborieuses radiomarqué en faveur des sondes étiquetées DIG. Nous avons choisi d'illustrer les étapes techniquement exigeante du protocole dans notre film.
Anna Karlgren et Jenny Carlsson ont contribué également à cette étude.
Correspondant auteurs: Anna Karlgren au Anna.Karlgren @ ebc.uu.se et Jens Sundström F. Jens.Sundstrom @ vbsg.slu.se
Protocol
Cet ARNm non radioactifs dans le protocole de l'hybridation in situ est optimisé pour les tissus d'épinette de Norvège et décrits en détail. Il est basé sur une Arabidopsis / colza dans le protocole de l'hybridation in situ optimisés dans nos groupes, qui à son tour est basé sur les protocoles de la Meyerowitz et des laboratoires irlandais et optimisé par Vivian irlandais, Cindy Lincoln et Jeff Long, entre autres 1-4.
PROCÉDURE
1. FIXATION ET INTÉGRATION
Pour fournir des tissus de rétention ARN doivent être fixés et intégrés dans de la cire avant une expérience in situ est réalisée. La fixation et l'inclusion est une étape critique puisque les matériaux mal fixés pourrait donner un signal faible ou indétectable, même si l'ARNm est très abondante. Les tissus sont déshydratés, effacé et intégrés dans de la cire dans les changements graduels pour éviter d'endommager les tissus. Afin d'éviter le rétrécissement et le gonflement des cellules NaCl à 0,85% est ajouté à l'éthanol étapes d'abord dans la déshydratation des tissus d'épinette de Norvège. Il est possible de laisser de côté le NaCl dans de l'éthanol (par exemple, il est laissé dans le protocole d'Arabidopsis / colza). L'étape de déshydratation pendant l'enrobage peut être effectué sur la glace pour maintenir l'activité RNase au minimum ou à +4 ° C. Dans ce protocole la solution de paraformaldéhyde 4% correctif contient glutaraldéhyde 0,25%, ce qui est censé donner une meilleure rétention d'ARN, même si certains affirment qu'il rend probablement pas de différence (par exemple, il est laissé dans le protocole d'Arabidopsis / colza). Très probablement toute fixation standard et le protocole intégrant peuvent être utilisés. Comme on le voit ci-dessous l'intégration de l'épinette de Norvège diffère légèrement du protocole Arabidopsis / colza.
1.1 Jour 1 Collecte de matériel végétal et la fixation de paraformaldéhyde
- Recueillir la matière végétale d'intérêt et de disséquer le cas échéant. Gardez les tissus sur la glace et les placer dans une solution de correction glacée (voir recettes ci-dessous), directement ou dès que possible. NB! Restez sur la glace tout le temps!
- Appliquer à vide pour les échantillons jusqu'à ce que le paraformaldéhyde commence à bouillonner. Tenez le vide pour un maximum de trois heures (par exemple 2 x 15 min pour Arabidopsis et les tissus floraux ou de colza d'une heure pour les cônes d'épinette de Norvège mâle) et libérer le vide lentement. Les tissus sont censés évier après l'infiltration sous vide du fixateur, mais pour certains tissus contenant beaucoup d'air, il n'est pas possible (les fleurs d'Arabidopsis, par exemple). Un morceau de gaze peut être utilisé pour fabriquer les tissus rester dans le fixateur.
- Remplacer le fixateur et incuber à 4 ° C pendant la nuit (~ 12-16 heures) en secouant doucement.
Option 1
NB! Version intégrant la Norvège épinette ci-dessous (étapes 4-8). Faire des tubes à scintillation sûr ou flacons en verre sont utilisés, au moins dans l'étape 5.
1.2 Jour 2 Déshydratation NB! Version intégrant la Norvège épinette.
Pause! Il est possible de s'arrêter là et de stocker les tissus dans EtOH à 70% + 0,85% de NaCl à +4 ° C pendant plusieurs mois.0,85% de NaCl 30 min sur la glace 50% EtOH + 0,85% de NaCl 90 min sur la glace 70% EtOH + 0,85% de NaCl 90 min sur la glace
NB! Eosine est ajouté à tacher les tissus roses qui les rend plus faciles à détecter pendant l'enrobage et le sectionnement, mais il peut être exclu.85% EtOH + 0,85% de NaCl 90 min 4 ° C 95% (+ éosine) EtOH 90 min 4 ° C 100% (+ éosine) EtOH 90 min 4 ° C 100% (+ éosine) EtOH nuit 4 ° C
1.3 Jour 3 La déshydratation et l'inclusion NB! Version intégrant la Norvège épinette.
| 100% (+ éosine) EtOH | 2 h | la température ambiante |
| 50% + 50% EtOH Histoclear II | 1 h | la température ambiante |
| 100% Histoclear II | 1 h | la température ambiante |
| 100% Histoclear II | 1 h | la température ambiante |
| 50% Histoclear II + Histowax 50% | nuit | 40-50 ° C |
1.4 Jour 4 NB Embedding! Version intégrant la Norvège épinette.
100% fondue Histowax 60 ° C (Matin et soir le changement)
1.5 Jour 5 NB Embedding! Version intégrant la Norvège épinette.
100% fondue Histowax 60 ° C (Matin et soir le changement)
1.6 Jour 6 Intégration NB! Version intégrant la Norvège épinette.
NB! Il est ok si la cire est parfois changé une fois par jour, mais alors il faut deux jours pour terminer une journée de changements. Le changement de la cire peut également se poursuivre pendant deux jours supplémentaires sans problème. Ceci est recommandé pour les grands échantillons, car il contribue à l'infiltration de la cire dans le centre de ces tissus.100% fondue Histowax 60 ° C (Matin et soir le changement)
Option 2
NB! Version intégrant Arabidopsis / colza ci-dessous (étapes 4-8).
1.2 Jour 2 Déshydratation NB! Arabidopsis / version intégrant de colza.
- NB! Toutes les étapes à +4 ° C et en secouant doucement, sinon c'est chose contraire.
Pause! Il est possible de s'arrêter là et de stocker les tissus dans EtOH à 70% à +4 ° C pendant plusieurs mois.1x PBS 30 min 1x PBS 30 min 30% EtOH 60 min 40% EtOH 60 min 50% EtOH 60 min 60% EtOH 60 min 70% EtOH 60 min
NB! Eosine est ajouté à tacher les tissus roses qui les rend plus faciles à détecter pendant l'enrobage et le sectionnement, mais il peut être exclu.85% EtOH 60 min 95% (+ éosine) EtOH nuit
1.3 Jour 3 La déshydratation et embeddING NB! Arabidopsis / version intégrant de colza.
- NB! Toutes les étapes à température ambiante et en secouant doucement, sinon le reste est déclaré.
NB! Transfert le tissu des flacons à scintillation ou d'autres (verre) flacons.100% (+ éosine) EtOH 30 min 100% (+ éosine) EtOH 30 min 100% (+ éosine) EtOH 60 min 100% (+ éosine) EtOH 60 min
NB! Dans la dernière étape de la concentration de Histowax n'est pas crucial, il suffit de verser dans certaines puces de cire.75% + 25% EtOH Histoclear II 30 min 50% + 50% EtOH Histoclear II 30 min 25% + 75% EtOH Histoclear II 30 min 100% Histoclear II 60 min 100% Histoclear II 60 min 100% Histoclear II + ¼ des volumes copeaux Histowax nuit (sans agitation)
1.4 Jour 4 NB Embedding! Arabidopsis / version intégrant de colza.
- Placer les flacons avec les tissus à 42 ° C jusqu'à ce que la cire fondue puces complètement. Ensuite, ajoutez ¼ du volume de copeaux de cire et les laisser fondre complètement. Déplacer à +60 ° C et laisser les flacons pendant plusieurs heures. Enfin, remplacez la cire / Histoclear II avec de la cire fondue fraîche et laisser incuber pendant la nuit à 60 ° C.
1.5 Jour 5 NB Embedding! Arabidopsis / version intégrant de colza.
100% fondue Histowax 60 ° C (Matin et soir le changement)
1.6 Jour 6 Intégration NB! Arabidopsis / version intégrant de colza.
NB! Dans le protocole d'Arabidopsis / colza (par rapport au protocole épinette de Norvège) il ya un Jour 7 Intégration de la même manière qu'à l'époque de 5-6, à savoir 100% Histowax fondu à 60 ° C et le changement du matin et du soir100% fondue Histowax 60 ° C (Matin et soir le changement)
NB! Il est ok si la cire est parfois changé une fois par jour, mais alors il faut deux jours pour terminer une journée de changements. Le changement de la cire peut également se poursuivre pendant deux jours supplémentaires sans problème. Ceci est recommandé pour les grands échantillons, car il contribue à l'infiltration de la cire dans le centre de ces tissus.
1.7 Jour 7 Embedding (Jour 8 dans le protocole d'Arabidopsis / colza) (Film! Les détails techniques sont montrées dans le film)
- Préchauffer boîtes de Pétri et / ou des moules à 60 ° C. Tourner sur une plaque chaude (60 ° C) et assurez-vous Histowax fondue est disponible.
- Verser les tissus et Histowax fondu dans une boîte de Pétri (ou un moule) placé sur la plaque chauffante. Ajouter plus Histowax sorte que les tissus sont couverts. Chauffer une paire de pinces et de distribuer équitablement les tissus dans le plat. Remplissez la boîte de Pétri (ou moule). Si la cire durcit avant que les tissus sont dans la bonne position, il chauffe ou retirez la cire durcie avec la paire de pincettes chauffées.
- Laissez la cire bloc de durcir à température ambiante avant de le placer à +4 ° C. Il est préférable de faire plusieurs blocs de cire au lieu d'incorporer les tissus trop serré puisque le bloc de cire pourrait fissurer lorsque des pièces sont coupées pendant la coupe.
Pause! Entreposer à 4 ° C Les tissus sont stables depuis des années.
NB! Travailler RNase exempte de cette étape et au-delà. Utiliser des gants, DEPC-traiter l'eau MilliQ, tampons, verrerie, etc tampons autoclave et cuire au four verrerie, etc, le cas échéant.
2. SECTIONNEMENT (détails techniques sont Film! montré dans le film)
- Tourner sur deux plaques de cuisson (60 ° C et +42 ° C) et assurez-vous Histowax fondue est disponible.
- La chaleur d'un scalpel et découpez soigneusement un bloc de cire de tissu de la boîte de Pétri (il pourrait se fissurer si on est trop violent), ou le retirer du moule. Quand un seul bloc de cire a été séparé, la forme du morceau dans la bonne taille et la forme pour faciliter le tranchage dans le microtome.
- Le morceau de cire doit avoir une cire supplémentaire «talon» sous le tissu de sorte qu'il peut être joint à la porte du bloc. Chauffer le détenteur de bloc et le talon sur la plaque chaude (60 ° C) et de les fusionner. Il pourrait être nécessaire de mettre sur une goutte de Histowax II pour rendre la fusion stable. Laisser durcir à +4 ° C.
- Couper le bloc de cire en 6-8 um d'épaisseur des sections reliées en un long ruban à l'aide d'un microtome.
NB! Ce sera plus facile si le bloc de cire est froid, stocker à savoir le bloc de cire à +4 ° C et l'amener dans le réfrigérateur lors du démarrage de la coupe. Il peut également être bénéfique pour garder le froid couteau. - Étude des rubans de sections dans un verre grossissant et marquer ceux qui seront utilisés.
- Mettez RNase MilliQ eau sur les lames (Probe-On Plus de Fisher biotechnologie, qui sont pré-nettoyées et chargées). Couper le ruban en petits morceaux et les mettre ("retour" ou "brillant" vers le bas) sur les lames. Les diapositives avec des rubans doivent être placés sur une plaque 42 ° C. Le ruban devrait s'aplatir (c'est important!) Dans l'eau. Que les sections asseoir pendant quelques minutes et ensuite utiliser un papier Kimwipe / tissu à drainer de l'eau.
- Laisser les lames sur la plaque pendant 1-2 heures.
- Incuber les lames à 42 ° C pendant la nuit afin que les tissus adhèrent aux diapositives.
Pause! Il est recommandé d'utiliser les sections les plus brefs délais, mais ils peuvent être stockés au sec dans des boîtes fermées avec dessicant jusqu'à plusieurs jours à +4 ° C.
3. LA FABRICATION DES SONDES
L'hybridation in situ en utilisant l'expression détecte une sonde spécifique étiquetés pour un ARNm donné. La sonde, qui est le plus souvent un morceau d'ARN complémentaires, peuvent être marqués à la digoxigénine, DIG. DIG est une petite molécule, qui peut être attaché à l'uridine et de ce fait intégré dans la sonde ARN et ensuite détecté grâce à DIG-anticorps spécifiques.
La conception et la fabrication de la sonde est l'étape la plus critique dans un ARN dans l'expérience hybridation in situ. Des précautions doivent être prises pour s'assurer que la sonde a une haute spécificité et est étiqueté avec des PDU de haute qualité. Parfois, l'hybridation de température et / ou la longueur de réaction doivent être ajustées pour des sondes spécifiques. Comme toujours, les soins devraient être prises pour éviter toute contamination de RNase.
Avant d'étiquetage, d'isoler un modèle selon vos protocoles standard, par exemple l'utilisation de clones d'ADNc, la PCR des fragments, et linéariser le modèle. Fragments sens et antisens sont isolés et amplifiés à partir du modèle en utilisant des amorces spécifiques du gène. Pour les fragments amplifiés par PCR de ne pas utiliser les enzymes qui produisent des surplombs 3 '. Pour tous les fragments une T7 (ou SP6 ou T3) surplomb est ajouté en utilisant des amorces portant le T7-séquence ou en utilisant un vecteur avec une T7-promoteur.
Le sens (ARNm ou (- brin)) sonde ont la même séquence que l'ARNm cible et ne seront pas s'hybrider à l'ARNm cible, tandis que l'antisens (anti-ARNm ou (+) des brins) sonde ont la séquence complémentaire et donc s'hybrider la cible de donner le signal d'intérêt. La sonde sens est utilisé comme contrôle négatif et aucun signal ne sera obtenu si l'expérience a fonctionné correctement. Un contrôle positif est également nécessaire, par exemple, une sonde qui détecte un gène de maintien de la maison. La majorité des diapositives doit être hybridé avec des sondes antisens, tandis que seulement quelques diapositives doivent être hybridés avec les sondes de contrôle différents.
3,1 étiquetage sonde en utilisant La transcription in vitro
Réactifs du kit DIG ARN Étiquetage (SP6/T7; 11175025910, Roche Applied Science, Mannheim, Allemagne) ou similaires sont utilisées lorsque le marquage des sondes. La réaction de 20 ul décrites ici devraient produire ~ 10 pg de DIG-ARN marqué.
- Faire une transcription in vitro à intégrer nucléotides marqués. Ajouter les réactifs suivants dans un tube de (garder sur la glace):
Ingrédient le volume / quantité 10 x mélange étiquetage NTP 2 pl 10 x tampon de transcription 2 pl Protecteur inhibiteur de RNase 1 pl (20U) L'ARN polymérase T7 (SP6 ou T3) 2 pl Matrice d'ADN (500-1000 ng) ul x RNase eau MilliQ ul y, pour un volume final de 18 ul - Mélanger le mélange de marquage NTP, tampon de transcription, inhibiteur de RNase (Attention, si la sonde est courte, par exemple <500bp, vous pouvez augmenter la concentration de l'inhibiteur de RNase à 40U), la polymérase, matrice d'ADN et de l'eau et ensuite centrifuger brièvement.
- Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 2 heures (Attention, si la sonde est courte, par exemple <500bp, augmenter le temps de réaction à 4-6 heures).
- Ajouter 2 ul DNase I et incuber à 37 ° C pendant 15 min.
- Arrêter la réaction par addition de 2 ul EDTA 0,2 M (pH 8,0). Vérifiez le produit sur gel.
- Précipiter la sonde en ajoutant 2,5 pi de 4 M LiCl et 75 ul d'éthanol> 99,5%. Bien mélanger et incuber à -20 ° C pendant la nuit (Attention Ne pas utiliser comme support ARNt. Utilisez plutôt le glycogène ou d'acrylamide selon les fabricants).
- Centrifugeuse (13 000 tpm) pendant 30 minutes à 4 ° C et retirer le surnageant. Laver le culot (au moins 10 min 13 000 tpm) deux fois dans de l'éthanol à 70% (~ 150 à 300 pl).
- Enlever le surnageant et laisser le culot sec. Resuspendre la sonde dans 30 pi d'eau sans RNase pendant 1-2 heures sur la glace.
Pause! La sonde peut être conservé à -20 ° C pendant plus d'un an.
NB! Enregistrer échantillons de 0,5 ul de l'étape 21 (avant la transcription in vitro), l'étape 23 (avant le traitement à la DNase), l'étape 24 (après le traitement à la DNase, mais avant la précipitation) et 1 échantillon de l'étape ul 27 (lorsque la sonde a été resuspendues). Exécuter les échantillons sur un gel de TBE nondenaturating 1%. Si la réaction DNAse a fonctionné correctement le modèle de bande disparaît. La transcription in vitro devrait générer une bande épaisse ARN d'environ la taille correcte. Si vous voyez des bandes multiples, dénaturer les échantillons à 80 ° C pendant 5 minutes suivie d'une trempe sur la glace avant le chargement. Si la reprise de l'étape 27 est mauvais il pourrait être ainsi parce que la sonde n'a pas été remis en suspension bien. Incuber l'ARN à +55 ° C minutes 5-10 à l'obtenir dans la solution.
3.2 L'hydrolyse de sondes longues
NB! Si votre sonde est supérieure à 150 pb il devrait être réduit à 50 à 150 pb à donner un signal élevé, en raison d'une meilleure pénétration. La sonde peut être chimiquement dégradés dans un tampon carbonate (pH 10,2). Si la sonde est de taille correcte sauter l'étape d'hydrolyse, mais n'oubliez pas d'ajouter un volume de formamide, soit 30 pi, à la sonde.
- Préparer 0,2 M bicarbonate de sodium (NaHCO 3) et 0,2 M de carbonate de sodium (Na 2 CO 3). Les deux doivent être fraîches.
- Testez les deux tampons en mélangeant 5 ml H 2 O, 2 ml de 0,2 M de NaHCO 3 et 3 ml 0,2 M Na 2 CO 3. Le pH doit être ~ 10.2.
- Calculer le temps d'incubation:
Le temps d'incubation (en minutes) = (L 0-L f) / (K * L 0 L * F) L 0 = longueur de départ de la sonde dans ko F L = longueur finale de la sonde dans ko = 0,100 par exemple ko K = constante de vitesse d'hydrolyse = 0,11 ko-1min-1 - Hydrolyser la moitié de votre sonde, sauver le reste pour plus tard. Diluer la sonde à 50 pi avec une RNase eau libre et ajouter 20 ul de 0,2 M NaHCO 3 (ajoutez d'abord) et 30 ul de 0,2 M Na 2 CO 3. Mélanger et incuber à 60 ° C pendant le temps d'incubation calculée.
- Arrêter la réaction en ajoutant 10 pl d'une M pH 4,7 NaOAc.
- Précipiter la sonde en ajoutant 10 ul de LiCl 4 M 2 et 300 pl éthanol (glycogène Utilisez NB! ou d'acrylamide en tant que support, si nécessaire). Incuber à -20 ° C la nuit.
- Centrifugeuse (13 000 tpm) pendant 30 minutes à 4 ° C et retirer le surnageant. Lavez les deux pastilles fois dans l'éthanol 70% (~ 300 pl.) Centrifugeuse (13 000 tpm) au moins 10 min à chaque lavage à +4 ° C.
- Enlever le surnageant et laisser le culot sec. Resuspendre la sonde dans 30 ul RNase MilliQ eau. Ajouter un volume de formamide, soit 30 pi, à la sonde.
Pause! La sonde peut être conservé à -20 ° C pendant plus d'un an.
NB! Prenez 2 pi de la sonde non hydrolysé et de 2 pi de la sonde hydrolysé (avant le formamide est ajoutée) et de vérifier sur un gel de TBE nondenaturating 1%. Il devrait y avoir une différence de taille entre les deux échantillons. Les sondes pourraient avoir besoin d'être dénaturé à 80 ° C pendant 5 minutes suivie d'une trempe sur la glace avant le chargement.
4. Hybridation in situ (les détails techniques sont Film! montré dans le film)
Assurez-vous que toutes les solutions sont RNase gratuit! Il n'est pas nécessaire de traiter tout au DEPC, mais d'utiliser au moins autoclavé MilliQ eau. Assurez-vous que toute la verrerie sont chauffés à 200 ° C durant la nuit ou au moins pendant 5 heures. Traiter des contenants de plastique et remuer les bars avec NaOH 0,1 M avec une agitation toute la nuit. Rincer les contenants en plastique à plusieurs reprises avec autoclave MilliQ-eau (~ 500 ml / conteneur). Il est crucial de se rincer les contenants avec soin pour éviter les traces de NaOH qui pourraient perturber l'hybridation. DEPC traiter toutes les solutions de stock, à l'exception du Tris-tampons. Vérifiez toutes les solutions etc avant de commencer l'expérience pour s'assurer que tout est disponible. Jusqu'à l'étape 61 (sauf les étapes 51-52) nous gardons les lames dans un rack, ce qui est facilement déplacé entre les conteneurs.
Dans la section 4.1 prétraitement in situ
- Déparaffiner / déshydratent sections:
2x 10 min Histoclear II (utiliser des récipients en verre) 2x 1-2 min à 100% EtOH 1-2 min EtOH à 95% 1-2 min EtOH 90% 1-2 min EtOH 80% 1-2 min EtOH 60% 1-2 min EtOH 30% 1-2 min H 2 O - Laver les lames pendant 15-20 min en 2x SSC à température ambiante temp (NB! Préparer le paraformaldéhyde utilisé à l'étape 42 pendant le temps d'incubation).
- Traiter les tissus pendant 30 min avec la protéinase K à 37 ° C avec agitation douce (par exemple 1 ug / ml pour Arabidopsis / colza et 3 pg / ml pour l'épinette de Norvège). Mélanger et préchauffer à 37 ° C Tris 100 mM pH 8 et 50 mM d'EDTA. Ajouter la protéinase K immédiatement avant le traitement des diapositives. NB! Le traitement protéinase K doit être optimisée en fonction des tissus, les espèces végétales et l'âge. (Attention Préparer la triéthanolamine utilisée à l'étape 45 pendant le temps d'incubation).
- Traiter les diapositives de 2 min avec 2mg/ml glycine dans du PBS 1x à température ambiante. (Attention Mélanger la glycine avec du PBS le jour avant de l'utiliser pour s'assurer que la glycine est bien dissous).
- Laver les lames pendant 2 minutes dans du PBS 1x à température ambiante.
- Laver les lames pendant 2 minutes dans du PBS 1x à température ambiante.
- Incuber les lames pendant 10 minutes avec 4% (p / v) paraformaldéhyde (fait frais) dans du PBS 1X pH 7 à température ambiante. Utiliser un récipient en verre.
- Laver les lames pendant 5 minutes dans du PBS 1x à température ambiante.
- Laver les lames pendant 5 minutes dans du PBS 1x à température ambiante. (Distribuer l'anhydride acétique dans la solution de l'étape 45).
- Incuber les lames pendant 10 minutes dans 0,1 M de triéthanolamine (fait frais, pH 8) et l'anhydride acétique à température ambiante.
- Laver les lames pendant 5 minutes dans du PBS 1x à température ambiante.
- Laver les lames pendant 5 minutes dans du PBS 1x à température ambiante.
- Déshydrater:
Pause! Il est possible de s'arrêter là et de stocker les lames dans un récipient avec une petite quantité d'EtOH dans le fond à +4 ° C pendant plusieurs heures.30 sec à 30% EtOH 30 sec à 60% EtOH 30 sec à 80% EtOH 30 sec à 90% EtOH 30 sec à 95% EtOH 2x 30 sec 100% EtOH
4.2 L'hybridation in situ (Film! Les détails techniques sont montrées dans le film)
Décidez qui glisse à l'emploi dont les sondes, n'oubliez pas d'utiliser les deux sens et sondes antisens ainsi que d'un contrôle positif. (Attention ProbeOn plus les diapositives de la biotechnologie Fisher ont un glaçage blanc qui leur permet d'être pris en sandwich en paires durant les étapes de l'hybridation / détection du protocole.) La même sonde avec la même concentration doit être utilisé sur une paire diapositive spécifique. Déterminer la solution d'hybridation combien de faire basé sur le nombre total de couples de diapositives. Préchauffer le sulfate de dextrane dans 60 ° C. La solution d'hybridation est très visqueux par le sulfate de dextrane. Mettez la solution d'hybridation dans les 60 ° C et il sera plus facile à manipuler. Air Sécher les lames sur du papier absorbant propre ou Kimwipe / tissu papiers avant de la sonde est appliquée. Les diapositives doivent être complètement secs. Pour chaque paire de glissières ajouter la sonde. Il est important de tester différentes concentrations de sonde (par exemple 0,5, 2 et 4 pl) pour trouver la concentration optimale avant l'expérience réelle est préformée.
| La solution d'hybridation | 5 paires glisser | 10 paires de diapositives | 15 paires de diapositives | 20 paires de diapositives |
| 10x en sels in situ | 100 ul | 200 pi | 300 pl | 400 pi |
| formamide désionisée | 400 pi | 800 pi | 1200 ul | 1600 ul |
| 50% de sulfate de dextrane (60 ° C) | 200 pi | 400 pi | 600 pi | 800 pi |
| 50x solution de Denhardt | 20 pl | 40 ul | 60 pl | 80 ul |
| ARNt (100mg/ml) | 10 ul | 20 pl | 30 pl | 40 ul |
| H 2 O (DEPC traitées) | 70 ul | 140 ul | 210 ul | 280 ul |
| Le volume total | 800 pi | 1600 ul | 2400 ul | 3200 ul |
- Diluer la sonde dans RNase MilliQ-eau pour un volume final de 20 pl. Ajouter un volume (soit 20 ul) formamide à la sonde qui donne un volume total de 40 pl. La chaleur de la sonde à 80 ° C pendant 2 minutes. Placez-le sur la glace pendant 2 min. Spin bas. Maintenir la sonde sur la glace. Cette sonde-mélange est assez pour une paire de lames. Multipliez selon le nombre total de paires de diapositives pour la sonde spécifique.
- Ajouter 160 ul de solution d'hybridation pour chaque paire de glissières qui donne un volume final de 200 pi (soit 160 ul solution d'hybridation de sonde + 40 ul) pour chaque paire de glissière. Mélanger sans générer de bulles.
- Appliquez la sonde à une diapositive et lentement fusionner les deux lames ensemble. (Sandwich NB! ne peut être fait avec la sonde sur des lames-Plus, ou diapositives équivalent. Si glisse sans givre sont utilisées utilisation des lamelles au lieu du sandwich.)
- Elevate diapositives ci-dessus des serviettes en papier humide dans un récipient en plastique (qui scelle hermétiquement) en utilisant des pipettes en plastique. Hybrider 50-55 ° C durant la nuit (12-16 heures).
4.3 Dans l'hybridation in situ après (Film! Les détails techniques sont montrées dans le film)
- Préparer l'hybridation in situ par le réchauffement après ~ 2 L 0,2 x SSC (55 ° C) et ~ 2 L 1x NTE (37 ° C) pendant la nuit. Plus SSC et NTE sont nécessaires si le traitement RNase (étapes 57 à 59 ci-dessous) est effectuée.
- Tremper chaque paire glisser dans 0,2 x SSC chaude (voir ci-dessus) de séparer et de les rincer. Puis les placer dans un rack dans un conteneuravec 0,2 x SSC chaleureuse.
- Laver les lames pendant 60 min en 0,2 x SSC avec une agitation douce à 55 ° C. (Attention Préparer la solution de bloc Boehringer utilisé dans l'étape 63 pendant le temps d'incubation).
- Répéter le lavage dans 0,2 x SSC pendant 60 min. (Attention Si l'étape est réalisée RNase laisser décongeler RNase pendant cette incubation, sinon passez à l'étape 60.)
- En option: Laver les lames pendant 5 min dans chaude 1x NTE (voir ci-dessus) à +37 ° C avec agitation douce.
- En option: Répéter le lavage dans les NTE 1x chaude pendant 5 min à 37 ° C avec agtation doux.
- En option: Traiter les lames avec de la RNase (20 ug / ml de RNase A en 1x NTE) pendant 30 min à 37 ° C avec agitation douce. Puis laver pendant 5 min dans NTE 1x à +37 ° C avec agitation douce. Répéter le lavage NTE 1x.
- Laver les lames pendant 60 min en 0,2 x SSC à 55 ° C avec agitation douce. (Attention Préparer la solution de bloc utilisé dans les étapes 64-65 et 67 pendant le temps d'incubation).
- Laver les lames pendant 5 min dans du PBS 1x à température ambiante (Pause! Vous pouvez stocker diapositives dans 1XPBS à +4 ° C pendant la nuit si vous voulez continuer le lendemain.)
- Placer les lames sur le fond d'un grand récipient en plastique avec le côté jusqu'à l'échantillon.
- Incuber les lames avec un bloc Boehringer 1% dans 100 mM de Tris pH 7,5, NaCl 150 mM pendant 45 min à température ambiante avec agitation douce. Juste couvrir les diapositives avec la solution de blocage. Décanter la solution de blocage lorsque les diapositives sont encore dans le récipient en plastique ou placer les diapositives dans un nouveau conteneur. Lorsque décanter la solution de la glisse en général respecter le récipient en plastique, mais de s'assurer qu'elles ne tombent pas sur le conteneur.
- Remplacer la solution de bloc Boehringer avec BSA 1,0% dans 100 mM de Tris pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,3% Triton X-100. Effectuer l'incubation comme dans l'étape 63.
- Diluer l'anticorps anti-DIG (1:1250, soit 8 anticorps ul dans 10 ml de BSA) dans la solution de BSA / Tris / NaCl / Triton de 64 étapes. Faire une flaque de solution d'anticorps dans un plastique pèsent plat. Sandwich diapositives ainsi que pour permettre aux forces capillaires de remonter la solution. Égoutter sur Kimwipe / mouchoir en papier et répétez, essayez d'éviter les bulles.
- Elevate diapositives ci-dessus des serviettes en papier humide dans un récipient en plastique et laissez les diapositives de s'asseoir à la température ambiante pendant 2 heures.
- Égoutter glisse sur Kimwipe / papier de soie et séparées. Placer sur le fond du récipient en plastique comme à l'étape 63. Lavez 4x dans la solution de BSA / Tris / NaCl / Triton. 15 min à chaque fois, l'agitation douce à température ambiante.
- 10 min Tris 100 mM pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl 2. Placer sur le fond du récipient en plastique comme à l'étape 63.
- Trempez glisser dans Tris pH 9.5/NaCl/MgCl deux solution pour assurer l'ensemble de détergent est lavé.
- Faire des sandwichs et d'élaborer des occidentaux solution de bleu comme en 65. Répéter une fois.
- Placer les lames dans un récipient en plastique au-dessus des serviettes en papier humide dans l'obscurité totale (envelopper dans du papier d'étain) pendant 1-5 jours à température ambiante. Vérifiez après les heures de 6, 12 et 24, puis une fois tous les jours.
- Diapositives Égoutter, rincer à l'1xTE pour arrêter la réaction. Mettez sur les feuillets de couverture avant les lames sont examinées au microscope. Les diapositives peuvent être sauvegardées dans 1x TE pour plusieurs mois, mais de prendre des photos dès que possible.
RECETTES / Solutions mères
NB! Utilisez RNase MilliQ eau autant que possible, par exemple DEPC traiter MilliQ-eau (Ajouter DEPC 0,1%. Laisser autoclave pendant la nuit. (20 minutes à 15 psi, soit 1,05 kg / cm 2, sur le cycle de liquide) ou d'utiliser au moins autoclavé MilliQ eau. Lors de la préparation des tampons et des solutions de stock, il est également possible de dissoudre les sels sans RNase etc DEPC eau traitée, au lieu de DEPC traiter les tampons et les solutions mères elles-mêmes. Si vous n'avez pas traiter l'eau DEPC , les tampons et les stock-solutions, au moins stériliser autoclave ou les filtrer.
Pause! Tampons magasin et le stock-solutions à la température ambiante, sinon c'est chose contraire.
NB! Vous pouvez trouver de nombreux tampons ainsi que des astuces sur la façon de les faire dans Molecular Cloning (Sambrook, J., et DW Russell. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual. 3 éd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA).
L'anhydride acétique dans 0,1 M de triéthanolamine (pH 8, volume: 800 ml).
| Ingrédient | le volume / quantité | concentration finale |
| Triéthanolamine | 10,4 ml | 0,1 M triéthanolamine |
| MilliQ eau | 786,4 ml | volume final de 800 ml |
| HCl | 3,2 ml | donnant un pH8,0 |
| L'anhydride acétique | 4,8 ml | 0,6% |
- Pour faire triéthanolamine 0,1 M, pH 8,0, diluer 10,4 ml de triéthanolamine dans 786,4 ml de H 2 O et ajoutez 3,2 ml de HCl pour amener le pH à 8,0 (vérifier avec indicateur de pH).
- Elevate support diapositive avec des pipettes en plastique cassée 10 ml ou similaires dans un conteneur de triéthanolamine avec un agitateur dans le fond.
- Distribuer 4,8 ml d'anhydride acétique dans la triéthanolamine quelques minutes avant de mettre diapositives en sorte qu'il est bien mélangé.
NB! Faites le 0.1M triéthanolamine fraîche et ajoutez l'anhydride acétique, juste avant l'incubation.
NB! Utiliser un récipient en verre. Triéthanolamine tampon doit être utilisé parce que l'anhydride acétique est instable dans l'eau.
Agarose (1%) de gel dans 1 x TBE (volume: 100 ml)
| Ingrédient | le volume / quantité | concentration finale |
| Agarose | 1 g | 1% |
| 1 x TBE | jusqu'à 100 ml |
Mélanger avec 1 x agarose TBE. Chaleur / bouillir jusqu'à ce que l'agarose a fondu. Cast un gel. Mettre le gel dans un tampon 1 x TBE.
Sulfate de dextran
Diluer 5 g de sulfate de dextrane à 10 ml avec DEPC traitées MilliQ-eau (soit 50% (p / v)) et dissoudre dans 60 ° C.
Pause! Conserver à -20 ° C.
EDTA 0,5 M pH 8,0 (Titriplex III, volume 500 ml)
| Ingrédient | le volume / quantité | concentration finale |
| EDTA (372,24 g / mol) | 93,06 g | EDTA 0,5 M |
| MilliQ eau | jusqu'à 500 ml | |
| NaOH | ~ 10 g granulés | donnant un pH de 8,0 |
| DEPC | 0,5 ml | 0,1% de DEPC |
Dissoudre l'EDTA dans l'eau (qui arrive à pH 8,0), ajuster à un volume final de 500 ml. Ajouter DEPC 0,1%. Laisser toute la nuit. Autoclave.
Solution Fix / fixateur (étapes 1-3, 42) - 4% (p / v) paraformaldéhyde dans du PBS 1X, pH 7,0 (650 ml)
| Ingrédient | le volume / quantité | concentration finale |
| MilliQ eau | 585 ml | |
| 10x PBS | 65 ml | 1x PBS |
| NaOH 10M | 520 ul | pH donnant ~ 11 |
| Paraformaldéhyde | 26 g | 4% |
| HCl concentré | 449 ul | pH ~ 7 donnant |
- Mélanger l'eau, PBS et NaOH et de chaleur pour 60 à 70 ° C (la température et le pH est élevé, il sera plus facile de dissoudre le paraformaldéhyde.
- Ajouter (dans la hotte) paraformaldéhyde.
- Lorsque la solution a autorisé, le placer sur la glace et ajuster le pH à 7,0 en ajoutant 449 ul d'HCl concentré.
NB! Faire frais.
NB! Dans le protocole de glutaraldéhyde épinette a été ajouté à une concentration finale de 0,25%, soit 6,5 ml de glutaraldéhyde à 25% du volume total de 650 ml ou 10 ml de glutaraldéhyde à 25% du volume total de 1000 ml (souvenez-vous de réduire l'eau avec une égale volume).
NB! Ajouter quelques gouttes de Tween 20 et / ou le Triton X-100, après le pH est ajusté, pour réduire la tension de surface pour faciliter la fixation dans les étapes 1-3. NE PAS utiliser à l'étape 42!
NB! Lors de la fixation des tissus végétaux un plus petit volume (par exemple 100 - 200 ml) de fixatif est généralement nécessaire.
10x en sels in situ (volume de 100 ml)
| Ingrédient | le volume / quantité | concentration finale |
| 5 M de NaCl | 60 ml | 3M NaCl |
| 1 M de Tris-Cl pH 8,0 | 10 ml | 0,100 M Tris |
| 1 M phosphate de Na pH 6,8 | 10 ml | 0,100 M phosphate de Na |
| EDTA 0,5 M | 10 ml | 0,050 M d'EDTA |
| MilliQ eau | jusqu'à 100 ml |
Mélanger un tampon phosphate Na avec un pH de 6,8 (46,3 ml 1 M Na 2 HPO 4 + 53,7 ml 1 M NaH 2 PO 4). Mélanger NaCl, Tris, phosphate de Na tampon, l'EDTA et l'eau. Autoclave. Pause! Conserver à -20 ° C.
4 M LiCl 2 (chlorure de lithium, volume: 100 ml)
| Ingrédient | le volume / quantité | concentration finale |
| LiCl 2 (42,39 g / mol) | 16,956 g | 4M LiCl 2 |
| MilliQ eau | jusqu'à 100 ml | |
| DEPC | 0,1 ml | 0,1% de DEPC |
Dissoudre 2 LiCl dans l'eau, ajuster à un volume final de 100 ml. Ajouter DEPC 0,1%. Laisser toute la nuit. Autoclave.
Pause! Entreposer à 4 ° C.
1 M MgCl 2 · H 2 O (chlorure de magnésium, volume: 100 ml)
| Ingrédient | le volume / quantité | concentration finale |
| MgCl 2 · H 2 O (203,30 g / mol) | 20,33 g | 1 M MgCl 2 · H 2 O |
| MilliQ eau | jusqu'à 100 ml | |
| DEPC | 0,1 ml | 0,1% de DEPC |
Dissoudre MgCl 2 dans l'eau, ajuster à un volume final de 100 ml. Ajouter DEPC 0,1%. Laisser toute la nuit. Autoclave.
NB! MgCl 2 est très hygroscopique. Ne pas stocker les bouteilles ouvertes pendant de longues périodes de temps.
5 M de NaCl (chlorure de sodium, de volume: 1 l)
| Ingrédient | le volume / quantité | concentration finale |
| NaCl (58,44 g / mol) | 292,2 g | 5 M de NaCl |
| MilliQ eau | à 1l | |
| DEPC | 1 ml | 0,1% de DEPC |
Dissoudre NaCl dans l'eau, ajuster à un volume final de 1 l. Ajouter DEPC 0,1%. Laisser toute la nuit. Autoclave.
1 M pH 4,7 NaOAc (acétate de sodium, de volume: 100 ml)
| Ingrédient | le volume / quantité | concentration finale |
| NaOAc (82,03 g / mol) | 0,8203 g | 1 M de NaOAc |
| MilliQ eau | jusqu'à 100 ml | |
| L'acide acétique | donnant un pH de 4,7 | |
| DEPC | 0,1 ml | 0,1% de DEPC |
Dissoudre NaOAc dans l'eau. Ajuster le pH à 4,7. Ajuster à un volume final de 100 ml. Ajouter DEPC 0,1%. Laisser toute la nuit. Autoclave.
0,2 M Na 2 CO 3 pH11.4 (carbonate de sodium, de volume: 10 ml)
| Ingrédient | le volume / quantité | concentration finale |
| Na 2 CO 3 | 0,21198 g | 0,2 M Na 2 CO 3 pH = 11,4 |
| MilliQ eau | jusqu'à 10 ml |
Dissoudre Na 2 CO 3 dans l'eau, ajuster à un volume final de 10 ml. Le pH doit être 11,4.
NB! Faire frais.
0,2 M de NaHCO 3 pH8.2 (bicarbonate de sodium, de volume: 10 ml)
| Ingrédient | le volume / quantité | concentration finale |
| NaHCO 3 | 0,16802 g | 0,2 M de NaHCO 3: pH = 8,2 |
| MilliQ eau | jusqu'à 10 ml |
Dissoudre NaHCO 3 dans l'eau, ajuster à un volume final de 10 ml. Le pH doit être 8,2.
NB! Faire frais.
1 M Na 2 HPO 4 · 2 H 2 O (volume de 500 ml)
| Ingrédient | le volume / quantité | concentration finale |
| Na 2 HPO 4 · 2 H 2 O (177,99 g / mol) | 88,995 g | 1 M Na 2 HPO 4 |
| MilliQ eau | jusqu'à 500 ml | |
| DEPC | 0,5 ml | 0,1% de DEPC |
Dissoudre Na 2 HPO 4 dans l'eau, ajuster à un volume final de 500 ml. Ajouter DEPC 0,1%. Laisser toute la nuit. Autoclave.
1 M NaH 2 PO 4 · H 2 O (volume de 500 ml)
| Ingrédient | le volume / quantité | concentration finale |
| NaH 2 PO 4 · H 2 O (137,99 g / mol) | 68,995 g | 1 M NaH 2 PO 4 |
| MilliQ eau | jusqu'à 500 ml | |
| DEPC | 0,5 ml | 0,1% de DEPC |
Dissoudre NaH 2 PO 4 dans l'eau, ajuster à un volume final de 500 ml. Ajouter DEPC 0,1%. Laisser toute la nuit. Autoclave.
NTE 5x (volume total: 1l)
| Ingrédient | le volume / quantité | concentration finale |
| 5 M de NaCl | 500 ml | 2,5 M de NaCl |
| 1 M de Tris-Cl pH 8 | 25 ml | 50 mM de Tris-Cl pH 8 |
| EDTA 0,5 M | 5 ml | EDTA 5 mM |
| MilliQ eau | 470 ml | 1l volume final |
Mélanger NaCl, Tris, EDTA et de l'eau. Ne pas traiter la DEPC. Autoclave.
10 x PBS (tampon phosphate salin) pH 7,0 (volume total: 1l)
| Ingrédient | le volume / quantité | concentration finale |
| 5 M de NaCl | 260 ml | 1,3 M de NaCl |
| 1 M Na 2 HPO 4 | 70 ml | 70 mM Na 2 HPO 4 |
| 1 M NaH 2 PO 4 | 30 ml | 30 mM NaH 2 PO 4 |
| MilliQ eau | 640 ml | 1l volume final |
| DEPC | 1 ml | 0,1% de DEPC |
Mélanger NaCl, Na 2 HPO 4, NaH 2 PO 4 et de l'eau. Ajuster le pH à pH 7,0 avec HCl. Ajouter DEPC 0,1%. Laisser toute la nuit. Autoclave.
20x SSC pH 7,0 (volume total: 1l)
| Ingrédient | le volume / quantité | concentration finale |
| NaCl (58,44 g / mol) | 175,32 g | 3 M de NaCl |
| Citrate de Na (294,1 g / mol) | 88,23 g | 0,300 M citrate de Na |
| MilliQ eau | jusqu'à 1 l | |
| HCl | donnant un pH de 7,5 | |
| DEPC | 1 ml | 0,1% de DEPC |
Dissoudre NaCl et Na citrate dans l'eau ~ 800 ml. Ajuster le pH à pH 7,0 avec HCl. Réglez le volume à 1 l avec de l'eau. Ajouter DEPC 0,1%. Laisser toute la nuit. Autoclave.
5 x TBE (volume: 1l)
| Ingrédient | le volume / quantité | concentration finale |
| Tris (121,14 g / mol) | 54 g | ~ 0,45 M Tris |
| L'acide borique (61,83 g / mol) | 27,5 g | ~ 0,45 M d'acide borique |
| EDTA (372,24 g / mol) | 3,7 g | ~ 0,01 M EDTA |
| MilliQ eau | à 1l |
Mélanger Tris, l'acide borique, de l'EDTA et l'eau. Le pH doit être ~ 8,3. Diluer à 1 x TBE avant utilisation.
10 x TE pH 8,0 (Tris EDTA, du volume: 1l)
| Ingrédient | le volume / quantité | concentration finale |
| 1 M de Tris-Cl, pH 8,0 | 100 ml | 0,100 M Tris-Cl |
| EDTA 0,5 M pH 8,0 | 100 ml | 0,050 M d'EDTA |
| MilliQ eau | à 1l |
Mélanger Tris, EDTA et de l'eau. Ne pas traiter la DEPC. Autoclave.
NB! Tris ne doit pas être traitée par DEPC! Utilisez RNase poudre et diluer avec de l'eau MilliQ DEPC-treated/RNase-free.
1 M Tris-HCl pH 7,5 - 9,5 (volume de 500 ml)
| Ingrédient | le volume / quantité | concentration finale |
| Tris (121,14 g / mol) | 60,57 g | Tris 1 M |
| MilliQ eau | jusqu'à 500 ml | |
| HCl | donnant un pH de 7,5 | |
| HCl | donnant un pH de 8,0 | |
| NaOH | donnant un pH de 9,5 |
Dissoudre Tris dans DEPC eau traitée. Ajustez le pH souhaité. Ajuster à un volume final de 500 ml. Autoclave.
NB! Tris ne doit pas être traitée par DEPC! Utilisez RNase poudre et diluer avec de l'eau MilliQ DEPC-treated/RNase-free.
NB! Dans le clonage moléculaire (voir ci-dessus), il ya un tableau décrivant combien concentrer HCl est nécessaire pour atteindre le pH correct.
MATÉRIEL ET MÉTHODES
Le protocole de situ est présentée ci-dessus et dans le film. Voici des informations supplémentaires sur le matériel végétal et les sondes utilisées dans cet exemple précis sont décrits.
Le matériel végétal et la conception expérimentale
Les cônes mâles de Picea abies [L.] Karst. (Épinette de Norvège) ont été collectés à Uppsala, en Suède, en automne 2007. Huit cônes ont été sectionnés et des sections dechaque cône ont été utilisés dans chaque traitement. Trois protéinase K concentrations ont été testées, 1, 3 et 5 pg / pl et chaque concentration ont été traités avec ou sans RNase. Diapositives pas traités avec la RNase ont été laissés en PBS pendant le traitement RNase. Arabidopsis thaliana [L.] Heynh. et Brassica napus L., ont été cultivées dans des conditions contrôlées en chambre de culture à 22 ° C/18 ° C températures jour / nuit et une photopériode de 16 h. Jeunes inflorescences contenant des boutons floraux, les étapes 00 à 10 (étapes selon Smyth 5) ont été étudiés.
sondes ARNc
L'ARN total a été isolé de P. abies cônes mâles, comme décrit précédemment et 6 de A. thaliana et B. napus utilisant Trizol (Gibco BRL, Frederick, Maryland, USA) et l'usine de Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Allemagne), respectivement, conformément aux recommandations des fabricants. L'ADNc a été synthétisé de 0,5 à 1 mg d'ARN total, selon les espèces, en utilisant Exposant III de la transcriptase inverse (Invitrogen, Carlsbad, Californie, USA) en suivant les instructions du fabricant. AtAP3 et BnAP3 sens et antisens fragments et P. fragments sens abies ont été isolés et amplifiés en utilisant des amorces spécifiques du gène (tableau 1). DAL13 fragments antisens ont été isolés et amplifiés en utilisant des amorces comme dans 7. Un faux T7 a été ajouté à partir de fragments de A. thaliana et P. abies utilisant modifiés amorces inverses portant le T7-séquence (Tableau 1). Un fragment de 500 pb a été isolé en utilisant des amorces spécifiques BnAP3 (tableau 1) et cloné dans un vecteur pGEM-T avec une T7-promoteur. Pour le P. abies fragments toutes les réactions PCR ont été réalisées dans un volume final de 20 ul contenant 0,2 Phusion U Haute-Fidility ADN polymérase (Finnzymes, Espoo, Finlande), 1x Phusion HF tampon, 200 uM de chaque dNTP, 0,3 uM de chaque apprêt et 25-50 ng d'ADNc et d'un programme standard de PCR a été utilisée avec la température de recuit de 60 à 55 ° C (touch-down -1 ° C / cycle) suivi par 55 ° C. Sens et antisens sondes ARNc pour les trois espèces ont été synthétisés avec transcription in vitro en utilisant le kit de marquage DIG ARN (SP6/T7; Roche Applied Science, Mannheim, Allemagne) selon les recommandations du fabricant et des sondes longues ont été digérés à environ 100-150 pb fragments en utilisant une Na 2 CO 3 tampons en fonction de trois.
RÉSULTATS
Ici, dans le résultat section, nous décrivons trois exemples différents des résultats typiques d'expériences in situ.
Le mécanisme génétique qui régule le développement de reproduction dans les gymnospermes et angiospermes par l'identité d'orgue précisant masculin et féminin semble être évolutif 7-9 conservé, malgré que les deux lignées végétales semences séparées 285.000.000 années il ya 10. Dans A. thaliana des gènes homéotiques floraux APETALA3 (AP3 11) et pistillata (PI 12) sont nécessaires et suffisantes pour préciser développement du système reproducteur masculin dans le contexte d'une fleur, et cette fonction semble être conservé au sein de l'angiosperme lignée 13. Dans les gymnospermes, qui manquent de fleurs et les organes reproducteurs sont séparés disposés en cônes mâles et femelles (figure 1A-C), les gènes homologues à AP3 et PI sont spécifiquement exprimés dans les organes contenant du pollen du cône mâle, le microsporophylls 7,14. Ainsi, un ensemble similaire de gènes homologues dans les deux angiospermes et gymnospermes définit les organes de pollen de roulement.
Sondes génétiques spécifiques dirigés contre AtAP3 et BnAP3, respectivement, ont donné des signaux de phase 3 chez les jeunes bourgeons floraux dans une région correspondant à verticille de deux et trois dans A. thaliana et B. napus. En plus tard, mis en scène les bourgeons les signaux ont été limitées aux pétales et les étamines de développement (Fig. 2A et B). Ces résultats sont en accord avec les études antérieures 11,15,16. Sondes dirigés vers l'homologue AP3 dans P. abies, DAL13, produit des signaux dans la microsporophylls de P. abies cônes mâles à la fois avant et après la cessation méristème apical (Fig. 2C et D), comme prévu à partir d'études antérieures 7,14. Sondes sens donné aucun signal de fond ci-dessus (Fig. 3A-B et les données non présentées). Pris ensemble, ces résultats démontrent l'expression de A. AP3 thaliana et ses orthologues dans B. napus et P. abies dans le développement des organes reproducteurs masculins.
Figure 1. A.thaliana et B. fleurs napus et le pollen des cônes mâles produisant de l'P. conifères Photos abies montrent des inflorescences aux bourgeons floraux et les fleurs ouvertes de A.thaliana et B.napus dans A et B respectivement. Notez que les fleurs des angiospermes en dehors de la périanthe stériles ports à la fois mâle et femelle organes reproducteurs; étamines et carpelles. Montré dans C est un rameau de l'P. gymnospermes abies avec aiguilles vert et rouge de reproduction végétative cônes mâles.
Figure 2. Expression de A. AP3 thaliana et de gènes homologues dans B. napus et P. abies. Micrographies montrent des sections longitudinales de A. thaliana et B. inflorescences napus en A et B, respectivement, et P. abies cônes mâles en C et D. Les articles hybridé avec des sondes antisens dirigés contre AtAP3 dans le signal A et montrent BnAP3 en B dans le deuxième et le troisième verticille organes floraux. Numéros indique les étapes floraux selon Smyth 5. Antisens dirigés vers la sonde le gène DAL13 a donné le signal de la microsporophylls contenant du pollen de P. abies cônes mâles, comme indiqué dans un CD. Exemples de microsporophylls sont indiquées par des flèches. Pointes de flèches au point AD au signal d'hybridation, qui apparaît comme le violet. En C et D composés phénoliques donnent couleur brunâtre non spécifiques à des cellules individuelles dans la moelle centrale. s, sépale, p, pétale; er, étamine, c, carpelle; ms, microsporophyll; PI, la moelle; pp; pré-pollen cellules. Bar: 100 um.
Figure 3. DAL13 expression dans les cônes mâles de P. abies. Tous les micrographies (AH), montrent des sections longitudinales des cônes mâles après la résiliation du méristème apical. Pointes de flèches point à des types de cellules dans lesquelles DAL13 est exprimée. Les articles dans A et B sont hybridés avec une sonde de contrôle afin de déterminer le sens coloration de fond. Micrographies C à H sont hybridés avec une sonde antisens DAL13. Les articles à partir d'expériences avec et sans RNase traitement sont indiquées en D, F, H et C, E, G respectivement. Micrographies d'expériences avec 1 ug / ml de protéinase K sont indiquées dans C et D, 3 pg / ml dans E et F, et 5 ug / ml dans G et H. Barre: 100 um.
Discussion
Deux aspects de la P. abies protocole ont été optimisés par rapport à la A. thaliana / B. napus protocole, le traitement et la RNase protéinase K concentration. La RNase supprime signaux de fond et augmente ainsi la spécificité de 17 signaux. Le traitement protéinase K est nécessaire pour perméabiliser les tissus afin de la sonde peut entrer et s'hybrident à la piscine d'ARN d'intérêt. La sonde antisens DAL13 a donné un signal plus élevé, sans RNase-traitement (Fig. 3C, E, G) par rapport aux articles traités à la RNase pendant 30 min (figure 2D, F et H). Depuis le RNase-traitement n'améliore pas le signal qu'il a été retiré du protocole. Le traitement protéinase K ont été testés à trois concentrations différentes; 1, 3 et 5 pg / ml. Dans le cas de P. abies un signal faible ou nul a été observé en utilisant 1 ug / ml de protéinase K (Fig. 3C-D). Un signal fort a été obtenue à la fois avec 3 pg / ml (Fig. 3E-F) et 5 pg / ml (Fig. 3G-H) protéinase K. Comme aucune différence apparente dans la force du signal a été trouvé lors de l'utilisation 5 ug / ml de protéinase K comparativement à 3 pg / ml, nous avons choisi d'utiliser 3 pg / ml dans notre protocole. Il est probable que la nécessité d'une concentration plus élevée de protéinase K à la p. abies cônes mâles par rapport aux A. thaliana et B. bourgeons floraux napus est due à des tissus plus compacte avec des niveaux plus élevés de composés phénoliques et des polysaccharides.
Lors de la fixation et l'inclusion des différences entre les A. thaliana / B. napus protocole et le P. abies protocole sont évidents. Le tissu d'intérêt est fixé à assurer la rétention de l'ARN et cela est une étape critique puisque les matériaux mal fixés pourrait donner un signal faible ou indétectable, même si l'ARNm est très abondante. Le tissu est déshydraté, effacé et intégrés dans de la cire dans les changements graduels pour éviter d'endommager les tissus et, dans certains protocoles de NaCl 0,85% est ajouté à l'éthanol dans la déshydratation de continuer à éviter le rétrécissement et le gonflement des 3 cellules. L'étape de déshydratation pendant l'enrobage peut être effectué sur la glace pour maintenir l'activité RNase au minimum. Dans le P. abies protocole de la solution de paraformaldéhyde 4% correctif contient glutaraldéhyde 0,25%, ce qui est censé donner une meilleure rétention d'ARN 17, même si certains prétendent que c'est sans doute ne font aucune différence 3. Après sectionnement de la matière est fixée sur des lames et prétraités (c'est à dire déparaffinées, réhydratées, perméabilisées, traitée pour réduire la liaison non spécifique de la sonde et enfin déshydratés) avant l'hybridation.
Dans le protocole présenté ici toute la procédure de détection peut être effectuée dans les laboratoires ordinaires, le signal se développe habituellement dans les 1-3 jours et le ratio entre le signal sur fond peuvent être surveillés en permanence. Le DIG sondes marquées donnent généralement un signal plus distinctes par rapport aux sondes marquées radioactives, sont plus stables et peuvent être réutilisés dans des expériences consécutives. D'autre part, la sensibilité est réduite par rapport aux sondes radioactives 17. L'hybridation in situ détecte l'expression en utilisant une sonde marquée spécifique pour un ARNm donné. Radio-étiquetage est une méthode de marquage robuste et sensible, mais elle nécessite la manipulation de la radioactivité et il faut plusieurs semaines avant que les résultats peuvent être détectés. Antigène sondes marquées d'autre part, sont plus stables, moins dangereux et nécessitent une exposition au milieu de détection de quelques jours seulement 17. Ainsi, l'antigène étiquetage méthodes sont actuellement dominant. L'étape la plus critique indépendamment du protocole est la conception de la sonde. Des précautions doivent être prises pour s'assurer que la sonde a une haute spécificité et est étiqueté avec des PDU de haute qualité. Parfois, l'hybridation de température et / ou la longueur de réaction doivent être ajustées pour des sondes spécifiques.
Notre protocole modifié en fonction des DIG sondes marquées facilitera la localisation de l'expression des ARNm simultanément en espèces allant de A. thaliana à P. abies, et devraient avec des ajustements mineurs soit utilisable dans d'autres espèces végétales. Le protocole a, à côté des cônes mâles, également été testé sur différentes étapes de pousses végétatives et dans des embryons zygotiques et somatiques de P. fois abies avec de bons résultats (résultats non publiés;. Karlgren et al.)
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous sommes très reconnaissants à Anders Bovin qui a fourni la musique de notre film et à Michael Stocks Elliot volontaire pour être la voix haut-parleur. Un soutien a été fourni par Carl Trygger Fondation, le programme de recherche stratégique agricole génomique fonctionnelle (AgriFunGen) à l'Université suédoise des sciences agricoles, le Conseil suédois de la recherche (VR), et le Conseil suédois de la recherche pour l'environnement, les sciences agricoles et l'aménagement du territoire (FORMAS ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic anhydride | Sigma-Aldrich | A6404-200ml | minimum 98% |
| Acrylamide, linear | Ambion | 9520 | |
| Anti-DIG-antibodies | Roche Group | ||
| Blocking reagent | Roche Group | 11 175 041 910 or 11 096 176 001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030-50g | minimum 98% |
| Deionized formamide | Sigma-Aldrich | ||
| Denhardts solution | Sigma-Aldrich | D2532-5ml | |
| DEPC, diethylpyrocarbonate | Sigma-Aldrich | ||
| Dextran sulfate | Sigma-Aldrich | ||
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Roche Group | 11175025910 | |
| Glutaraldehyde (25%) | Histolab | ||
| Glycogen | Ambion | 9510G | |
| Histoclear II | Histolab | You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue. | |
| Histowax | Histolab | Histowax or Paraplast can be used for embedding. | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500g | |
| Paraplast plus | Sigma-Aldrich | P3683-1kg | Histowax or Paraplast can be used for embedding. |
| Phusion™ High-Fidility DNA Polymerase | Finnzymes | ||
| Probe-on Plus slides | Fisher Scientific | 22-230-900 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-5mg | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R5503-100mg | |
| Tissue-clear | Sakura Finetek | You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue. | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | T1377-100ml | minimum 98% |
| Triton X-100 | use your standard product in the lab | Use one or both of Triton X-100 and Tween-20. | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 83853-100mg | |
| Tween-20 | use your standard product in the lab | Use one or both of Triton X-100 and Tween-20. | |
| Western Blue | Promega Corp. |
References
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