Summary
우리는 수정된 발굴을 설명
Abstract
높은 처리량 표현 분석 기술을 사용할 수 있기 때문에 오늘날 각각의 조직을 해부에 문제가 제한됩니다 과학자에게 표현 프로필 오버플로하지만, 구체적인 조직 표현의 측면에서 그들의 해상도를 제공합니다. 표현 데이터 확인 및 세포 특정 mRNA 표현을 집중하기 위해 현장 하이브리드화, 사용 기술의 예를 사용하여 표현식 패턴을 구비해야합니다. 현장 하이브 리다이 제이션 방식으로이 힘드는, 시간이 많이 걸리는이며 종종 종과 조직에 따라 광범위한 최적화가 필요합니다. 원위치 실험에서 같은 침엽수 노르웨이 스프루스 (피세아 아비 에스)로 우디 수종으로 수행하기 위해 상대적으로 더 어렵습니다. 여기 P. 포함한 식물 종의 다양한에서 빠르게 적용 현장 하이브리드화 프로토콜에서 수정된 파고를 제시 아비 에스. 변경된 RNase 처리 및 proteinase K 농도를 포함한 몇 가지 조정을 통해, 우리는 동종 한 gymnosperm의 남성 생식 기관의 유전자 두 angiosperm 종의 조직 구체적인 표현을 연구하기 위해 프로토콜을 사용할 수 있습니다; P. 아비 에스, Arabidopsis thaliana와 Brassica napus. 프로토콜은 공부 종 및 유전자 동일하게하였습니다. AtAP3과 BnAP3가 A에서 두 번째 및 세 번째 윤생체 플로랄 장기에서 관찰되었다 thaliana와 B. P.에서 남성 원뿔의 microsporophylls에 napus와 DAL13 아비 에스. P. 들어 아비 에스의 조직을 permeablize하는 데 사용되는 proteinase K의 농도는, 3 증가야만 G / ML 대신 1 개 소형 조직 및 phenolics와 다당류의 높은 수준을 가능으로 인해 G / ML. 모든 종족에 대한 RNase 처리는 특이성에 해당 증가없이 감소 신호 강도로 인해 제거되었습니다. 꽃 식물과 구과를 맺는 나무 모두의 상동 유전자의 조직 구체적인 표현 패턴을 비교하여 우리가 현장 프로토콜의 파고는 분 조정, 여기를 제시 것을 보여주는 식물 종의 다양한 적용할 수 있습니다. 따라서 프로토콜은 광범위한 종 특정 최적화 및 발굴 분류 프로브에 찬성 radioactively 레이블 프로브의 힘드는 사용 모두를 방지합니다. 우리는 영화에있는 프로토콜의 기술적 요구하는 단계를 설명하기 위해 선택했습니다.
안나 Karlgren 제니 칼슨은이 연구에 동등하게 공헌했습니다.
해당 저자 : Jens.Sundstrom @ vbsg.slu.se에서 Anna.Karlgren @ ebc.uu.se와 젠스 F.의 Sundström에 안나 Karlgren
Protocol
현장 하이브리드화 프로토콜이 아닌 방사성 mRNA는 노르웨이 스프루스 조직에 최적화된하고 자세하게 설명되어 있습니다. 이것은 차례로 Meyerowitz과 아일랜드 실험실에서 프로토콜을 기반으로하고 다른 1-4 중 비비안 아일랜드어, 신디 링컨과 제프 롱하여 최적의 그룹에 최적화된 현장 하이브리드화 프로토콜에 Arabidopsis / 유채를 기반으로합니다.
절차
1. 고정 및 포함
RNA 보존 조직을 제공하기 위해서는 현장 실험이 수행되기 전에하려하고 왁스에 포함된해야합니다. 제대로 고정 재료는 mRNA가 매우 풍부에도 불구하고 낮은 또는 탐지 신호를 줄 수 있으므로 고정 및 삽입은 중요한 단계입니다. 조직은 취소 및 조직 손상을 방지하기 위해 점진적 변화의 왁스에 포함된, 탈수 있습니다. 추가로 0.85 % NaCl이 노르웨이 스프루스 조직의 탈수 최초의 에탄올 단계에 추가되는 세포의 수축과 팽창을 방지하려면. 에탄올에 NaCl (예가 Arabidopsis / 유채 프로토콜에서 왼쪽)을두고하는 것이 가능합니다. 퍼가기 동안 탈수 단계 ° C. 최소한 또는 4에서 RNase 활동을 유지하기 위해 얼음을 수행할 수 있습니다 이 프로토콜에서는 4 % paraformaldehyde의 해결책은 비록 일부는 아마도 아무런 차이를 (예를 들어 그것이 Arabidopsis / 유채 프로토콜에서 왼쪽)을하지 않습니다 주장하는 더 나은 RNA 유지를 제공하도록되어 0.25 %의 글루 타 알데히드를 포함하고 있습니다. 대부분의 표준 고정 및 삽입 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 으로 노르웨이 스프루스 포함 아래 보지는 Arabidopsis / 유채 프로토콜에서 약간 다릅니다.
1.1 1 일 수집 공장 자재 및 paraformaldehyde 고정
- 관심의 식물 자료를 수집하고 필요한 경우를 해부하다. 얼음에 조직을 유지하고 직접 또는 가능한 한 빨리 (아래 요리법 참조) 얼음처럼 차가운 해결책에서 그들을 놓으십시오. NB! 얼음에있는 모든 시간을 유지하라!
- paraformaldehyde가 거품이 시작 때까지 샘플을 진공을 적용합니다. 최대 세 시간 (예 : 2 Arabidopsis와 유채 꽃 조직이나 노르웨이 스프루스 남성 원뿔 한 시간 X 15 분)에 대한 진공을 잡고 천천히 진공을 풀어주고있다. 조직은 정착액의 진공 침투 후 싱크대로했는데 공기를 많이 포함하는 특정 조직을 위해 (예 : Arabidopsis의 꽃) 불가능합니다. 거즈의 조각은 조직이 정착액에 체류하기 위해 사용할 수 있습니다.
- ° C 숙박 (~ 12~16시간)가 가볍게 떨고 사에서 정착액과 부화를 교체하십시오.
옵션 1
NB! 아래 노르웨이 스프루스 포함 버전 (4-8 단계). 확실히 섬광의 튜브를 만들거나 유리 튜브는 최소한 5 단계에서 사용됩니다.
1.2 일이 탈수 NB! 노르웨이 스프루스 포함 버전입니다.
일시 중지! ° C 몇 달 동안 네 이곳 중지하고 70% EtOH + 0.85 % NaCl의 조직을 저장할 수도 있습니다.0.85 % NaCl 30 분 얼음 50% EtOH + 0.85 % NaCl 90 분 얼음 70% EtOH + 0.85 % NaCl 90 분 얼음
NB! Eosin는 그들이 쉽게 삽입하고 sectioning 동안 감지하는 분홍색 조직을 얼룩에 추가했지만 그것은 제외될 수 있습니다.85% EtOH + 0.85 % NaCl 90 분 4는 ° C 95% EtOH (+ eosin) 90 분 4는 ° C 백퍼센트 EtOH (+ eosin) 90 분 4는 ° C 백퍼센트 EtOH (+ eosin) 밤새 4는 ° C
1.3 3 일 탈수와 NB를 삽입! 노르웨이 스프루스 포함 버전입니다.
| 백퍼센트 EtOH (+ eosin) | 2 H | 실온 |
| 50% EtOH + 50% Histoclear II | 1 H | 실온 |
| 백퍼센트 Histoclear II | 1 H | 실온 |
| 백퍼센트 Histoclear II | 1 H | 실온 |
| 50% Histoclear II + 50 % Histowax | 밤새 | 40-50들은 ° C |
1.4 일 4 임베딩 NB! 노르웨이 스프루스 포함 버전입니다.
백퍼센트 녹은 Histowax 60도 ° C (변경 아침과 저녁)
1.5 5 일째 퍼가기 NB! 노르웨이 스프루스 포함 버전입니다.
백퍼센트 녹은 Histowax 60도 ° C (변경 아침과 저녁)
1.6 6 일 퍼가기 NB! 노르웨이 스프루스 포함 버전입니다.
NB! 왁스가 종종 하루에 한 번 변경하면 괜찮지만, 다음 변경 사항 중 하루를 완료하는 데 이틀이 소요됩니다. 왁스의 변화도 문제없이 2 일간 추가 계속할 수 있습니다. 그것이 조직의 중심에 왁스의 침투를하는 데 도움이 이후이 큰 샘플을 권장합니다.백퍼센트 녹은 Histowax 60도 ° C (변경 아침과 저녁)
옵션 2
NB! 아래 Arabidopsis / 유채 퍼가기 버전 (4-8 단계).
1.2 일이 탈수 NB! Arabidopsis / 유채 포함 버전입니다.
- NB! 다른 적혀있다하지 않을 경우 사의 모든 단계 ° C 부드럽게, 떨고.
일시 중지! ° C 몇 달 동안 네 이곳 중지하고 70 % EtOH에 조직을 저장할 수도 있습니다.1X PBS 30 분 1X PBS 30 분 30% EtOH 60 분 40% EtOH 60 분 50% EtOH 60 분 60% EtOH 60 분 70% EtOH 60 분
NB! Eosin는 그들이 쉽게 삽입하고 sectioning 동안 감지하는 분홍색 조직을 얼룩에 추가했지만 그것은 제외될 수 있습니다.85% EtOH 60 분 95% EtOH (+ eosin) 밤새
1.3 3 일 탈수 및 embedd불라 불라 NB! Arabidopsis / 유채 포함 버전입니다.
- NB! 모두 상온에서 단계가 아닌 다른 경우에는 부드럽게, 흔들림가 적혀있다.
NB! 섬광의 튜브 또는 기타 (유리) 튜브로 조직을 전송합니다.백퍼센트 EtOH (+ eosin) 30 분 백퍼센트 EtOH (+ eosin) 30 분 백퍼센트 EtOH (+ eosin) 60 분 백퍼센트 EtOH (+ eosin) 60 분
NB! 마지막 단계에서 Histowax의 농도가 중요하지, 그냥 왁스 칩을 부어.75% EtOH + 25% Histoclear II 30 분 50% EtOH + 50% Histoclear II 30 분 25% EtOH + 75% Histoclear II 30 분 백퍼센트 Histoclear II 60 분 백퍼센트 Histoclear II 60 분 백퍼센트 Histoclear II + ¼ 볼륨 Histowax 칩 숙박 (NO 흔들어)
1.4 일 4 임베딩 NB! Arabidopsis / 유채 포함 버전입니다.
- 왁스 칩을 완전히 녹아 ° C까지 42에서 조직으로 튜브를 삽입합니다. 다음 왁스 칩 ¼ 볼륨을 추가하고 그들이 완전히 녹여 보자. 60로 이동 ° C와 몇 시간 동안 튜브를 두십시오. 마지막으로, 60 밤 동안 갓 녹인 왁스와 부화 ° C.와 왁스 / Histoclear II를 교체
1.5 5 일째 퍼가기 NB! Arabidopsis / 유채 포함 버전입니다.
백퍼센트 녹은 Histowax 60도 ° C (변경 아침과 저녁)
1.6 6 일 퍼가기 NB! Arabidopsis / 유채 포함 버전입니다.
NB! Arabidopsis / 유채 프로토콜 (노르웨이 가문비나무 프로토콜에 비해)에서 일 5-6에서와 동일한 방법으로 일 7.2 퍼가기가, 60에서 즉, 백퍼센트 녹아 Histowax ° C 및 변경 아침과 저녁백퍼센트 녹은 Histowax 60도 ° C (변경 아침과 저녁)
NB! 왁스가 종종 하루에 한 번 변경하면 괜찮지만, 다음 변경 사항 중 하루를 완료하는 데 이틀이 소요됩니다. 왁스의 변화도 문제없이 2 일간 추가 계속할 수 있습니다. 그것이 조직의 중심에 왁스의 침투를하는 데 도움이 이후이 큰 샘플을 권장합니다.
1.7 일 7.2 퍼가기 (Arabidopsis / 유채 프로토콜의 날 8) (Film! 기술 정보가 영화에 표시됩니다)
- 60에 앞서 열을 가하다 배양 접시 및 / 또는 금형이 ° C. 뜨거운 접시에 턴 (60 ° C)과 녹아 Histowax 사용할 수 있는지 확인하십시오.
- 뜨거운 접시에 놓인 페트리 접시 (또는 주형)으로 조직과 녹은 Histowax 하거라. 조직이 보상되도록 더 Histowax을 추가합니다. 족집게 한 켤레를 가열하고 균일하게 접시에 조직을 배포합니다. 페트리 접시 (또는 곰팡이) 입력합니다. 조직이 올바른 위치에 전에 왁스가 견고면, 다시 그것을 가열하거나 족집게의 온수 쌍의로 강화된 왁스를 제거합니다.
- 4에 그것을 배치하기 전에 상온에서 왁스 블록 강화를하자 ° C. 그 대신 조각 sectioning 도중 그만 때 왁스 블록 균열 수 있으므로 너무 단단히 조직을 포함 여러 왁스 블록을 만드는 것이 좋습니다.
일시 중지! 4 AT & 스토어데그, C. 조직은 수년 동안 안정합니다.
NB! 이 단계와 이후 RNase 무료로 작동합니다. 장갑을 사용 MilliQ - 물, 버퍼, 유리 등 압력솥 버퍼 구워 유리 등 적절한 DEPC는 - 치료.
2. (Film! 기술 정보가 영화에 표시됩니다) SECTIONING
- 이 뜨거운 접시에 턴 (60 ° C와 42 ° C)과 녹아 Histowax 사용할 수 있는지 확인하십시오.
- 메스를 가열하고 조심스럽게 페트리 접시 (하나는 너무 폭력적있다면 그것이 균열 수도)에서 조직의 왁스 블록을 잘라내거나 곰팡이에서 제거합니다. 단일 왁스 블록이 분리되면, 마이크로톰에 깔끔히을 촉진 권리 크기와 모양으로 조각을 모양.
- 그것이 블록 홀더에 장착할 수 있도록 왁스 조각은 조직 아래에 여분의 왁스 "뒤꿈치"이됩니다. 핫 플레이트 (60 ° C)에서 블록 홀더와 뒤꿈치를 열 그들을 융합. 그것은 융합 안정 수 있도록 Histowax II의 드롭에 넣어 필요할 수도 있습니다. 4에서하든 그것을 보자 ° C.
- 마이크로톰를 사용하여 긴 리본으로 연결되어 6-8 μm의 두께 부분에 왁스 블록 컷.
NB! 왁스 블록 감기, 즉 저장소가 네에있는 왁스 블록 경우이 쉽게 될 ° C와 절삭을 시작할 때 냉장고에서 그것을 가지고. 또한 칼 추위를 유지하기 위해 도움이 될 수 있습니다. - 돋보기에서 섹션의 리본을 연구하고 사용할 수있는 것들을 표시합니다.
- (프로브 - 온 플러스 미리 청소하고 비용이 청구됩니다 피셔 생명 공학에서) 슬라이드에 RNase 무료 MilliQ - 물을 넣어. 작은 조각에 리본을 잘라 슬라이드에 (아래 "뒤로"또는 "반짝"쪽)을 넣어. 리본과 함께 슬라이드는 42 ° C 플레이트에 배치해야합니다. 리본은 물 속에 (이것이 중요입니다!) 밖으로 평평하게해야합니다. 섹션 몇 분 동안 앉아 다음 물을 배수하는 Kimwipe / 조직 종이를 이용하자.
- 1-2시간 위해 접시에 슬라이드를 둡니다.
- 조직도 슬라이드에 맞게 ° C 밤새도록 42에 슬라이드를 품어.
일시 중지! 이것은 최대한 빨리 섹션을 사용하는 것이 좋습니다,하지만 그들은 네에서 며칠까지 건조 ° C.와 닫힌 상자에 건조 저장할 수 있습니다
3. 프로브 제작
원위치 하이브리드화에서는 특정 mRNA의 표시 프로브를 사용하여 특정 표현을 감지합니다. 가장 많이 보완 RNA의 조각 프로브, digoxigenin, 디그 태그 수 있습니다. 디그가 유리딘에 붙어함으로써 발굴 특정 항체를 사용하여 검색 후 RNA 프로브에 통합하여 사용할 수있는 작은 분자이다.
설계 및 프로브의 제작은 현장 하이브리드화 실험에서 RNA에서 가장 중요한 단계입니다. 케어는 탐사선이 높은 특이성을 가지고 있으며, 양질의 UTPs로 분류되어 있는지 확인하십시오로 이동해야합니다. 가끔 하이브리드화 온도 및 / 또는 반응 길이는 특정 프로브에 따라 조정해야합니다. 언제나처럼, RNase의 오염을 피하기 위해주의 주의해야한다.
라벨 전에 표준 프로토콜을 따라 템플릿을 분리 예 cDNA 클론, PCR - 조각을 사용하여 템플릿을 linearize. 감각과 안티 센스 조각은 격리 및 유전자 특정 primers를 사용하여 템플릿에서 증폭됩니다. PCR 증폭 단편 3 'overhangs을 생산 효소를 사용하지 마십시오하십시오. 모든 조각에 T7 (또는 SP6 또는 T3) 오버행은 T7 - 시퀀스를 들고 primers를 사용하거나 T7 - 프로 모터와 벡터를 사용하여 추가됩니다.
감각 (mRNA 또는 (-) 가닥)이 프로브는 대상 mRNA와 동일한 순서를 가지고 대상 mRNA에 잡종을하지 않습니다, 안티 센스 (안티 mRNA 또는 (+) 가닥) 탐사선이 보완적인 시퀀스를 동시에하기 때문에하는 잡종 관심의 신호를 제공 대상. 감지 프로브는 대조군으로 사용되고 실험이 제대로 작동하는 경우에는 신호 획득되지 않습니다. 긍정적인 통제는 집 지키는 유전자를 감지 프로브 예를 들어, 필요합니다. 단지 몇 슬라이드가 서로 다른 제어 프로브에 hybridized해야하는 동안 슬라이드의 대부분은 안티 센스 프로브와 함께 hybridized해야합니다.
시험 관내 전사에서 사용하는 3.1 프로브 라벨
발굴 RNA 라벨링 키트 (SP6/T7, 11175025910, 로체 응용 과학, 만하임, 독일)에서 시약 프로브를 라벨 때 또는 그와 유사한이 사용됩니다. 디그 - 분류 RNA의 ~ 10 μg를 얻을 수 있어야 20 μl 반응은 여기에 설명되어 있습니다.
- 분류 세포핵을 통합할 수의 시험 관내 전사하십시오. 튜브 (얼음에 보관)에 다음과 같은 시약을 추가합니다 :
성분 볼륨 / 금액 10 × NTP 라벨 혼합물 2 μl 10 X의 전송 버퍼 2 μl 수호자 RNase 저해제 1 μl (20U) RNA T7 효소 (SP6 또는 T3) 2 μl 템플릿 DNA (500-1000 NG) X μl RNase 무료 MilliQ - 워터 18 μl의 최종 볼륨 Y의 μl, - NTP 라벨 혼합물, 전송 버퍼, RNase 억제제를 혼합 (NB! 탐사선이 짧은 경우, 예를 들어 <500bp, 당신이 40U에 RNase 억제제 농도를 증가시킬 수 있습니다), 효소, 템플릿 DNA와 물 그리고 짧게 원심 분리기.
- 37에서 반응 믹스를 품어 ° 2 시간 C (NB! 탐사선이 짧은 경우, 예를 들어 <500bp, 4-6 시간 반응 시간을 증가).
- 15 분 37 2 μl DNase I 및 부화 ° C를 추가합니다.
- 2 μl 0.2 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (산도 8.0)을 추가하여 반응을 중지합니다. 겔에서 제품을 확인합니다.
- 4 M LiCl 및> 99.5 %의 에탄올의 75 μl 2.5 μl를 추가하여 탐사선을 촉진. 잘 믹스하고 -20 ° C에서 품어 하룻밤 (NB!는 이동 통신사로 tRNA를 사용하지 마십시오. 대신에 글리코겐이나 아크릴 아미드 제조 업체에 따라 사용).
- 4에서 30 분 원심 분리기 (13 000 RPM) ° C 및 뜨는을 제거하십시오. 70 % 에탄올의 펠릿 (적어도 10 분 13 000 RPM)을 차례로 두 번 (~ 150-300 μl) 씻으십시오.
- 뜨는을 제거하고 펠릿 건조하자. 얼음 1-2시간 30 μl RNase없는 물속에 프로브를 Resuspend.
일시 중지! 프로브 년 이상 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
NB! 단계 27 (탐사선이되었을 때부터 단계 21 조 (시험 관내 전사의 이전) 단계 월 23 일 (DNase 처리하기 전에), 스텝 24 (DNase 처리 후에, 그러나 강수량 전) 0.5 μl 샘플을 저장, 1 μl 샘플 ) resuspended. nondenaturating 1 % TBE 젤에서 샘플을 실행합니다. DNase 반응이 효과가있다면 적절하게 템플릿 밴드가 사라집니다. 의 시험 관내 전사는 약 올바른 크기의 두꺼운 RNA 밴드를 생성해야합니다. 여러 개의 밴드를 볼 경우,로드하기 전에 얼음 담금질 다음 5 분 80 ° C에서 샘플을 denaturate. 단계 27에서 복구 나쁜 보이는 경우 프로브 잘 resuspended되지 않았기 때문에 그렇게 될 수도 있습니다. ° C 50~10분이 솔루션에 그걸 얻기 위해 55에서 RNA를 품어.
긴 프로브 3.2 가수 분해
NB! 귀하의 프로브 150 BP보다 큰 경우가 더 나은 침투 때문에 높은 신호를주고 50-150 BP로 축소해야합니다. 탐사선은 탄산 버퍼 (산도 10.2)에 화학적으로 저하 수 있습니다. 프로브는 가수 분해 단계 건너 올바른 크기이지만, 프로브 하나의 볼륨 포름 아미드, 즉 30 μl를 추가하는 기억하십시오.
- 0.2 M 나트륨 중탄산염 (NaHCO 3)은 0.2 M의 나트륨 탄산염 (나 2 CO 3) 준비합니다. 모두 신선해야합니다.
- 혼합 5 ML H 2 O 2, ML 0.2 M NaHCO 3 세 ML 0.2 M 나 2 CO 3 두 버퍼를 테스트합니다. 산도 ~ 10.2되어야합니다.
- 배양 시간을 계산 :
배양 시간 (분) = (L 0 - L F) / (K * L * L 0 F) KB 단위 프로브의 L 0 = 시작 길이 L F KB 단위 프로브의 = 최종 길이 = 예 : 0.100 킬로바이트 가수 분해 = 0.11 킬로바이트 - 1min - 1 K = 속도 상수 - 귀하의 프로브의 절반을 Hydrolyze, 나중에 나머지를 저장합니다. RNase 무료 물로 50 μl에 프로브를 희석 20 μl 0.2 M NaHCO 3 (첫번째 추가) 30 μl 0.2 M 나 2 CO 3를 추가합니다. 믹스와 계산 부화 시간을위한 60 ° C에서 알을 품다.
- 1 M NaOAc 산도 4.7 10 μl를 추가하여 반응을 중지합니다.
- 10 μl 4 M LiCl이 300 μl ethano을 추가하여 탐침을 촉진L (필요한 경우 캐리어로 NB! 사용 글리코겐이나 아크릴 아미드). 하룻밤 -20 ° C에서 알을 품다.
- 4에서 30 분 원심 분리기 (13 000 RPM) ° C 및 뜨는을 제거하십시오. 70 % 에탄올 (~ 300 μl)에서 펠렛을 차례로 두 번 씻으십시오. 4 각 씻어에서 원심 분리기 (13 000 RPM) 적어도 10 분 ° C.
- 뜨는을 제거하고 펠릿 건조하자. 30 μl RNase - 무료 MilliQ - 물속에 프로브를 Resuspend. 프로브 한 볼륨 포름 아미드, 즉 30 μl를 추가합니다.
일시 중지! 프로브 년 이상 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
NB! unhydrolyzed 프로브 2 μl와 분해 프로브 2 μl를 (포름 아미드이 추가되기 전에) 타고 nondenaturating 1 % TBE 젤을 확인합니다. 두 샘플 사이의 크기 차이가있을 것입니다. 프로브 로딩하기 전에 얼음 담금질 다음 5 분 80 ° C에서 denaturated해야 할 수도 있습니다.
4. 원위치 하이브리드화 IN (Film! 기술 세부 사항은 영화에서 표시됩니다)
모든 솔루션은 RNase 무료입니다 있는지 확인하십시오! 그것은 DEPC - 처리 모든 필요는 아니지만 MilliQ - 물을 최소한 autoclaved을 사용합니다. 모든 유리 제품은 200에서 가열되어 있는지 확인 ° C 5시간 밤새 적어도. 플라스틱 용기를 취급하고 야간 동요와 0.1 M NaOH로 바 저어. autoclaved MilliQ - 물 (~ 500 ML / 컨테이너)와 플라스틱 용기를 여러 번 씻어. 그것은 하이브리드화 방해 수도 NaOH의 흔적을 피하기 위해 조심스럽게 용기를 씻어하는 데있어 매우 중요합니다. DEPC - 처리 트리스 - 버퍼를 제외하고, 모든 주식 솔루션을. 모든 것을 사용할 수 있도록 실험을 시작하기 전에 모든 솔루션 등을 확인합니다. 단계 61 (51-52 단계는 제외)까지 우리가 쉽게 컨테이너간에 이동 선반에 슬라이드를 유지.
현장 섹션 전처리 4.1
- 섹션을 탈수 / Deparaffinize :
2X 10 분 Histoclear II (유리 용기 사용) 2X 1-2 분 백퍼센트 EtOH 1-2 분 95% EtOH 1-2 분 90 % EtOH 1-2 분 80 % EtOH 1-2 분 60 % EtOH 1-2 분 30 % EtOH 1-2 분 H 2 O - 방 온도 (NB!이 부화 기간 동안 단계 42 사용 paraformaldehyde 준비)에서 2X SSC에서 15-20 분 슬라이드를 씻으십시오.
- 37에서 proteinase K 30 분 조직을 취급 ° 부드러운 교반과 C (예 : 1 Arabidopsis / 유채에 대한 μg / ML 3 노르웨이 스프루스에 대한 μg / ML). 37에 믹스 앤 앞서 열을 가하다 ° C 100 MM 트리스 산도 8 50 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산). 즉시 슬라이드를 치료하기 전에 proteinase K를 추가합니다. NB! proteinase K 처리는 조직, 식물의 종류와 연령에 따라 최적화되어야합니다. (NB!이 부화 기간 동안 단계 45 사용 triethanolamine 준비).
- 상온에서 1X PBS에 2mg/ml 글리신 2 분 슬라이드를 처리합니다. (NB!은 글리신가 제대로 해소되도록 그것을 사용하기 전에 하루를 PBS로 글리신을 섞는다.)
- 상온에서 1X PBS 2 분 동안 슬라이드를 씻으십시오.
- 상온에서 1X PBS 2 분 동안 슬라이드를 씻으십시오.
- 상온에서 1X PBS pH의 7 4 % (W / V) paraformaldehyde (신선한 만든)과 함께 10 분 동안 슬라이드를 품어. 유리 용기를 사용하십시오.
- 상온에서 1X PBS로 5 분 슬라이드를 씻으십시오.
- 상온에서 1X PBS로 5 분 슬라이드를 씻으십시오. (단계 45 솔루션에 아세트산 무수물를 분배).
- 0.1M triethanolamine (신선한 산도 8 만든)과 실온에서 아세트산 무수물에서 10 분 동안 슬라이드를 품어.
- 상온에서 1X PBS로 5 분 슬라이드를 씻으십시오.
- 상온에서 1X PBS로 5 분 슬라이드를 씻으십시오.
- 탈수 :
일시 중지! 그것은 ° C 몇 시간 동안 네 이곳 중지하고 하단에 EtOH의 소량이있는 용기에 슬라이드를 저장할 수 있습니다.30 초 30% EtOH 30 초 60% EtOH 30 초 80% EtOH 30 초 90% EtOH 30 초 95% EtOH 2X 30 초 백퍼센트 EtOH
원위치 하이브리드화 (Film! 기술 정보가 영화에 나와 있습니다)에서 4.2
어떤 프로브와 함께 사용하는 슬라이드를 결정, 감각과 안티 센스 프로브뿐만 아니라 긍정적인 제어를 모두 사용하는 것을 잊지 마세요. (NB! ProbeOn 플러스 피셔 바이오에서 슬라이드 그들이 프로토콜의 하이브리드화 / 검색 단계 동안 쌍에 끼워 넣었지 수있게 흰 설탕 프로 스팅이 있습니다.) 같은 농도와 동일한 프로브는 특정 슬라이드 쌍을에 사용해야합니다. 슬라이드 쌍 총 수를 기반으로 만드는 방법을 많이 하이브 리다이 제이션 솔루션을 확인합니다. 앞서 열을 가하다 60 ° C.에 Dextran 황산 하이브 리다이 제이션 솔루션은 Dextran 황산에서 매우 점성이다. 60에서 하이브 리다이 제이션 솔루션을 넣어 ° C 그리고 처리 쉬울 것입니다. 프로브가 적용되기 전에 깨끗한 종이 타월이나 Kimwipe / 조직 용지에 슬라이드를 공기 건조. 슬라이드가 완전히 건조되어야합니다. 슬라이드의 각 쌍에 대한 탐사를 추가합니다. 실제 실험이 preformed되기 전에 최적의 농도를 찾기 위해 다른 프로브 농도 (예 : 0.5, 2 및 4 μl)을 테스트하는 것이 중요합니다.
| 하이브 리다이 제이션 솔루션 | 5 슬라이드 쌍 | 10 슬라이드 쌍 | 15 슬라이드 쌍 | 20 슬라이드 쌍 |
| 현장 소금의 10 배 | 100 μl | 200 μl | 300 μl | 400 μl |
| deionized 포름 아미드 | 400 μl | 800 μl | 1,200 μl | 1,600 μl |
| 50% Dextran 황산 (60 ° C) | 200 μl | 400 μl | 600 μl | 800 μl |
| 50x Denhardt의 솔루션 | 20 μl | 40 μl | 60 μl | 80 μl |
| tRNA (100mg/ml) | 10 μl | 20 μl | 30 μl | 40 μl |
| H 2 O (DEPC가 치료) | 70 μl | 140 μl | 210 μl | 280 μl |
| 총 부피 | 800 μl | 1,600 μl | 2,400 μl | 3,200 μl |
- 20 μl의 최종 볼륨 RNase - 무료 MilliQ - 물속에 프로브를 희석. 40 μl의 총 볼륨을주는 탐사에 포름 아미드 하나의 볼륨 (예 : 20 μl)을 추가합니다. 80 프로브를 가열 ° C 2 분. 2 분 얼음에 놓습니다. 스핀 다운. 얼음에 프로브를 유지. 이 프로브 - 혼합물은 슬라이드 중 하나 쌍에 대한 충분하다. 특정 프로브에 대한 슬라이드 쌍 총수에 따라 곱하면됩니다.
- 각 슬라이드 쌍 200 μl의 최종 볼륨 (즉, 160 μl 하이브 리다이 제이션 용액 + 40 μl 프로브)를주는 슬라이드의 각 쌍에 대한 하이브 리다이 제이션 용액 160 μl를 추가합니다. 거품을 발생시키지 않고 섞는다.
- 슬라이드에 프로브를 적용하고 천천히 함께 두 슬라이드를 융합. (NB!의 Sandwiching에만 설탕을 입힘없이 슬라이드를 사용하는 경우 프로브가 온 플러스 슬라이드, 슬라이드 또는 이와 동등한. sandwiching 대신 커버 전표를 사용 할 수 있습니다.)
- 플라스틱 pipettes를 사용하여 플라스틱 용기 (밀봉 단단히)에서 서부 유럽 표준시 종이 타올 위에 슬라이드를 위로 향하게. 잡종 50-55 ° C 야간 (12~16시간).
현장 포스트 하이브 리다이 제이션 (Film! 기술 정보가 영화에 나와 있습니다)에서 4.3
- 온난화에 의해 원위치 포스트 하이브 리다이 제이션에 준비 ~ 2 L 0.2x SSC (55 ° C)와 ~ 2 L 1X NTE (37 ° C) 하룻밤. RNase 처리 (아래의 단계 57-59)가 수행하는 경우 더 많은 SSC와 NTE이 필요합니다.
- 그들을 분리하고 린스에 따뜻한 0.2x SSC (위 참조)로 각 슬라이드 쌍을 찍어. 다음 컨테이너에 선반에 배치따뜻한 0.2x SSC와 함께.
- 55에서 부드러운 교반과 0.2x SSC 60 분 슬라이드를 씻어 ° C. (NB!는 배양 시간 동안 단계 63에서 사용 Boehringer 블록 솔루션을 준비합니다.)
- 60 분 0.2x SSC의 세척을 반복합니다. (RNase 단계가 60 단계를 계속하지 않으면,이 부화하는 동안 RNase의 해동을하게 수행하는 경우 NB!.)
- 옵션 : 37에서 따뜻한 1X NTE에서 5 분 (위 참조)에 대한 슬라이드를 씻으 ° C 부드러운 선동과 함께.
- 옵션 : 37시 5 분 따뜻한 1X NTE의 세척을 반복 ° C를 부드러운 agtation와 함께.
- 옵션 : 37시 30 분 RNase (20 μg / ML RNase 1X NTE에서) · 부드러운 동요와 C와 함께 슬라이드를 드셔보세요. 그렇다면 37에서 1X의 NTE 5 분 씻어 ° C를 부드러운 선동과 함께. 1X NTE 세척을 반복합니다.
- ° C 부드러운 교반과 함께 55에서 0.2x SSC 60 분 슬라이드를 씻으십시오. (NB!는 부화 시간 동안 단계 64-65와 67에서 사용되는 블록 솔루션을 준비합니다.)
- 온도는 실온에서 1X PBS로 5 분 (Pause! 당신은 4에서 1XPBS에서 슬라이드를 저장할 수 있습니다 ° C 하룻밤은 다음날 계속하려는 경우.)에 대한 슬라이드를 씻어
- 샘플 측면 든 커다란 플라스틱 용기의 하단에있는 슬라이드를 삽입합니다.
- 부드러운 교반과 실온에서 45 분 100 MM 트리스 산도 7.5, 150 MM NaCl의 1퍼센트 Boehringer 블록과 슬라이드를 품어. 그냥 차단 솔루션으로 슬라이드를 커버. 슬라이드 아직도 플라스틱 용기에하거나 새 용기에 슬라이드를 삽입하는 동안 차단 솔루션을 하거라. 솔루션을 붓는하면 일반적으로 플라스틱 용기에 충실하지만, 그들은 컨테이너에서 떨어지지 않도록 슬라이드.
- 100 MM 트리스 산도 7.5, 150 MM NaCl, 0.3 % 트리톤 X - 100 1.0 %의 BSA와 Boehringer 블록 솔루션을 교체합니다. 단계 63로 배양을 수행합니다.
- 단계 64에서 BSA / 트리스 / NaCl / 트리톤 솔루션 안티 발굴 항체를 (10 ML BSA에 1:1250, 즉 8 μl 항체) 희석. 플라스틱 항체 솔루션의 웅덩이를 확인하면 요리를 달다. 샌드위치는 모세관 세력이 솔루션을 올려 수 있도록 함께 슬라이드. Kimwipe / 조직 종이에 드레인과 거품을 피하기 위해 노력 반복한다.
- 플라스틱 용기에 젖은 종이 타월 위에 슬라이드를 제고하고 슬라이드 2 시간 동안 실내 온도에 앉을 수 있습니다.
- Kimwipe / 조직 종이와 별도의 슬라이드 드레인. 단계 63로 플라스틱 용기의 바닥에 놓습니다. BSA / 트리스 / NaCl / 트리톤 솔루션 4X 씻으십시오. 15 분 각 시간, 상온에서 부드러운 선동.
- 10 분 100 MM 트리스 산도 9.5, 100 MM NaCl, 50 MM MgCl 2. 단계 63로 플라스틱 용기의 바닥에 놓습니다.
- 세제의 모든을 보장하기 위해 트리스 산도 9.5/NaCl/MgCl이 솔루션 딥 슬라이드 씻어 있습니다.
- 샌드위치를 만들어 65로 서양 푸른 솔루션을 그립니다. 한 번 반복합니다.
- 플레이스 상온에서 1~5일에 대한 전체 어둠 (주석 호일에 포장)에서 서부 유럽 표준시 종이 타올 위에 플라스틱 용기에 슬라이드. 한 후 6, 12, 24 시간 매일 이후에 확인하십시오.
- 드레인 슬라이드는 반응을 중지 1xTE에 린스. 슬라이드가 현미경으로 검사하기 전에 표지 전표 입어. 슬라이드가 몇 달 동안 1X TE에 저장하지만 최대한 빨리 사진을 찍어 수 있습니다.
조리법 / 재고 솔루션
NB! RNase 무료 MilliQ - 물을 최대한 예 DEPC - 처리 MilliQ - 물 (0.1 % DEPC를 추가합니다. (15 PSI 20 분 하루. 압력솥을 남겨, 즉 액체의 생리주기에 1.05 ㎏ / cm 2) 또는이에서 사용을 사용하여 최소 autoclaved MilliQ - 물. 버퍼 및 재고 솔루션을 준비하는 때 대신 버퍼 및 재고 솔루션 스스로 DEPC - 치료의 DEPC - 처리된 물에 RNase 무료 소금 등을 분해하는 것도 가능합니다. 당신은 DEPC - 치료 물이 없다면 , 버퍼 및 주식 솔루션은 최소한 압력솥이나 필터를 소독.
일시 중지! 상온에서 저장 버퍼 및 주식 솔루션은 다른 명시된 경우 않습니다.
NB! 당신은 버퍼뿐만 아니라 (샘브룩, J., 그리고 DW 러셀. 2001 분자 복제에서 그들을 만드는 방법에 대한 힌트 많이 찾을 수 있습니다. 분자 복제 연구실 매뉴얼 3. 에드. 콜드 스프링 하버 연구소 보도 자료, 콜드 스프링 하버, 뉴욕, 미국).
0.1M triethanolamine에 아세트산 무수물 (산도 8, 볼륨 : 800 ML).
| 성분 | 볼륨 / 금액 | 최종 농도 |
| Triethanolamine | 10.4 ML | 0.1 M triethanolamine |
| MilliQ - 워터 | 786.4 ML | 최종 볼륨 800 ML |
| HCL | 3.2 ML | 산도를 제공8.0 |
| 아세트산 무수물 | 4.8 ML | 0.6 % |
- 0.1 M triethanolamine 버퍼, 산도 8.0, H 2 O의 786.4 ML에 triethanolamine의 희석 10.4 ML을 만들어 8.0 (산도 표시기 확인)로 산도를 가지고 HCL의 3.2 ML를 추가하려면 다음과 같이하십시오.
- 깨진 10 ML의 플라스틱 pipettes 또는 하단에 저어 표시줄과 triethanolamine의 용기에 유사한 함께 슬라이드 랙을 향상.
- 몇 분 때문에 잘 혼합한다는 점에서 슬라이드를 올려 놓기 전에 triethanolamine에 4.8 ML 아세트산 무수물 하는걸.
NB! 0.1M triethanolamine 신선하고 바로 부화하기 전에 추가 아세트산 무수물하십시오.
NB! 유리 용기를 사용하십시오. 아세트산 무수물가 물에 불안정 때문에 Triethanolamine 버퍼 사용할 수 있습니다.
1 X TBE의 아가로 오스 (1 %) 젤 (볼륨 : 100 ML)
| 성분 | 볼륨 / 금액 | 최종 농도 |
| 아가로 오스 | 1g | 1퍼센트 |
| 1 X TBE | 100 ML에 |
1 X TBE와 믹스 아가로 오스. 열 / 종기 아가로 오스는 녹아 때까지. 젤 캐스트. 1 X TBE 버퍼에서 젤을 실행합니다.
Dextran 황산
DEPC - 처리 MilliQ - 물 (예 : 50 % (W / V))로 5g Dextran 황산 10 ML로 희석하고 60 ° C.에 용해
일시 중지! -20 ° C.에 저장
0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) pH8.0 (titriplex III, 볼륨 500 ML)
| 성분 | 볼륨 / 금액 | 최종 농도 |
| EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (372.24 g / 몰) | 93.06 g | 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) |
| MilliQ - 워터 | 최대 500 ML에 | |
| NaOH | ~ 10g 알약 | 산도 8.0을 제공 |
| DEPC | 0.5 ML | 0.1 % DEPC |
물 (산도 8.0에서 발생)에 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 해산, 500 ML의 최종 볼륨을 조절할 수 있습니다. 0.1 % DEPC를 추가합니다. 밤이여 둡니다. 압력솥.
4퍼센트 (W / V) 1X PBS, pH를 7.0 (650 ML)에 paraformaldehyde - 솔루션 / 정착액을 (단계 1-3, 42) 수정
| 성분 | 볼륨 / 금액 | 최종 농도 |
| MilliQ - 워터 | 585 ML | |
| 10X PBS | 65 ML | 1X PBS |
| 10M NaOH | 520 μl | 주는 산도 ~ 11 |
| Paraformaldehyde | 26g | 4퍼센트 |
| 집중 HCL | 449 μl | 주는 산도 ~ 7 |
- 60-70로 믹스, 물, PBS 및 NaOH와 열 ° C (온도와 높은 산도가 쉽게 paraformaldehyde를 해산하는 것입니다.
- (펌 모자) paraformaldehyde를 추가합니다.
- 솔루션이 해제되면 얼음에 넣고 449 μl 집중 HCL을 추가하여 7.0 산도를 조정합니다.
NB! 신선합니다.
NB! 스프루스 프로토콜 글루 타 알데히드에서 0.25 %, 650 ML 또는 1000 ML의 총 부피 10 ML 25 % 글루 타 알데히드의 총 볼륨 즉, 6.5 ML 25 % 글루 타 알데히드의 최종 농도에 추가되었습니다 (동등한와 물을 줄이기 위해 기억 볼륨).
NB! 산도가 조정된 후 1-3 단계의 고정을 촉진하기 위하여 표면 장력을 줄이기 위해, 트윈 20 및 / 또는 트리톤 X - 100의 몇 방울을 추가합니다. STEP 42 사용하지 마십시오!
NB! 식물 조직에게 작은 볼륨 (예 : 100-200 ML) 고정하면 정착액의 대부분은 일반적으로 필요합니다.
현장 소금에서 10X (볼륨 100 ML)
| 성분 | 볼륨 / 금액 | 최종 농도 |
| 5 M NaCl | 60 ML | 3M NaCl |
| 1 M 트리스 - CL의 산도 8.0 | 10 ML | 0.100 M 트리스 |
| 1 M 나 인산 산도 6.8 | 10 ML | 0.100 M 인산 나 |
| 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | 10 ML | 0.050 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) |
| MilliQ - 워터 | 100 ML에 |
산도 6.8 (46.3 ML 1 M 나 2 HPO 4 + 53.7 ML 1 M 아니 2 PO 4) 나 인산 버퍼를 섞는다. 믹스 NaCl, 트리스, 나 인산 버퍼, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 물. 압력솥. 일시 중지! -20 ° C.에 저장
4 M LiCl 2 (염화 리튬, 볼륨 : 100 ML)
| 성분 | 볼륨 / 금액 | 최종 농도 |
| LiCl 2 (42.39 g / 몰) | 16.956 g | 4M LiCl 2 |
| MilliQ - 워터 | 100 ML에 | |
| DEPC | 0.1 ML | 0.1 % DEPC |
물에 LiCl 2 디졸브, 100 ML의 최종 볼륨을 조절할 수 있습니다. 0.1 % DEPC를 추가합니다. 밤이여 둡니다. 압력솥.
일시 중지! 4에서 보관 ° C.
1 M MgCl 2 · H 2 O (마그네슘 염화물, 볼륨 : 100 ML)
| 성분 | 볼륨 / 금액 | 최종 농도 |
| MgCl 2 ㆍ H 2 O (203.30 g / 몰) | 20.33 g | 1 M MgCl 2 · H 2 O |
| MilliQ - 워터 | 100 ML에 | |
| DEPC | 0.1 ML | 0.1 % DEPC |
물에 MgCl 2 디졸브, 100 ML의 최종 볼륨을 조절할 수 있습니다. 0.1 % DEPC를 추가합니다. 밤이여 둡니다. 압력솥.
NB! MgCl 2 매우 흡습입니다. 오랜 기간 동안 연 병을 보관하지 마십시오.
5 M NaCl (나트륨 염화물, 볼륨 : 1 L)
| 성분 | 볼륨 / 금액 | 최종 농도 |
| NaCl (58.44 g / 몰) | 292.2 g | 5 M NaCl |
| MilliQ - 워터 | 최대 1리터에 | |
| DEPC | 1 ML | 0.1 % DEPC |
물에 NaCl을 디졸브, 1 나의 최종 볼륨 조절 0.1 % DEPC를 추가합니다. 밤이여 둡니다. 압력솥.
1 M NaOAc 산도 4.7 (아세트산 나트륨, 볼륨 : 100 ML)
| 성분 | 볼륨 / 금액 | 최종 농도 |
| NaOAc (82.03 g / 몰) | 0.8203 g | 1 M NaOAc |
| MilliQ - 워터 | 100 ML에 | |
| 초산 | 산도 4.7 제공 | |
| DEPC | 0.1 ML | 0.1 % DEPC |
물에 NaOAc을 디졸브. 4.7으로 산도를 조정합니다. 100 ML의 최종 볼륨을 조절할 수 있습니다. 0.1 % DEPC를 추가합니다. 밤이여 둡니다. 압력솥.
0.2 M 나 2 CO 3 pH11.4 (나트륨 탄산, 볼륨 : 10 ML)
| 성분 | 볼륨 / 금액 | 최종 농도 |
| 나 2 CO 3 | 0.21198 g | 0.2 M 나 2 CO 3 산도 = 11.4 |
| MilliQ - 워터 | 최대 10 ML에 |
물 2 CO 3 나 디졸브, 10 ML의 최종 볼륨을 조절할 수 있습니다. 산도 11.4되어야합니다.
NB! 신선합니다.
0.2 M NaHCO 3 pH8.2 (나트륨 중탄산염, 볼륨 : 10 ML)
| 성분 | 볼륨 / 금액 | 최종 농도 |
| NaHCO 3 | 0.16802 g | 0.2 M NaHCO 3 : 산도 = 8.2 |
| MilliQ - 워터 | 최대 10 ML에 |
물에 NaHCO 3 디졸브, 10 ML의 최종 볼륨을 조절할 수 있습니다. 산도는 8.2 있어야합니다.
NB! 신선합니다.
1 M 나 2 HPO 4 명이 2 H 2 O (볼륨 500 ML)
| 성분 | 볼륨 / 금액 | 최종 농도 |
| 나 2 HPO 4 명이 2 H 2 O (177.99 g / 몰) | 88.995 g | 1 M 나 2 HPO 4 |
| MilliQ - 워터 | 최대 500 ML에 | |
| DEPC | 0.5 ML | 0.1 % DEPC |
물 속에 나 2 HPO 4 디졸브, 500 ML의 최종 볼륨을 조절할 수 있습니다. 0.1 % DEPC를 추가합니다. 밤이여 둡니다. 압력솥.
1 M은 아니 2 PO 4 명이 H 2 O (볼륨 500 ML)
| 성분 | 볼륨 / 금액 | 최종 농도 |
| 아니 2 PO 4 명이 H 2 O (137.99 g / 몰) | 68.995 g | 1 M 아뇨 2 PO 4 |
| MilliQ - 워터 | 최대 500 ML에 | |
| DEPC | 0.5 ML | 0.1 % DEPC |
이 아니 물에 PO 4 디졸브, 500 ML의 최종 볼륨을 조절할 수 있습니다. 0.1 % DEPC를 추가합니다. 밤이여 둡니다. 압력솥.
5 배 NTE (총 볼륨 : 일리터)
| 성분 | 볼륨 / 금액 | 최종 농도 |
| 5 M NaCl | 500 ML | 2.5 M NaCl |
| 1 M 트리스 - CL의 산도 8 | 25 ML | 50 MM 트리스 - CL의 산도 8 |
| 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | 5 ML | 5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) |
| MilliQ - 워터 | 470 ML | 최종 볼륨 1리터 |
믹스 NaCl, 트리스, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 물. DEPC - 취급하지 마십시오. 압력솥.
10 × PBS (인산염 버퍼 호수) 산도 7.0 (총 볼륨 : 일리터)
| 성분 | 볼륨 / 금액 | 최종 농도 |
| 5 M NaCl | 260 ML | 1.3 M NaCl |
| 1 M 나 2 HPO 4 | 70 ML | 70 MM 나 2 HPO 4 |
| 1 M 아뇨 2 PO 4 | 30 ML | 30 MM 아니 2 PO 4 |
| MilliQ - 워터 | 640 ML | 최종 볼륨 1리터 |
| DEPC | 1 ML | 0.1 % DEPC |
믹스 NaCl, 나 2 HPO 4, 아니 2 PO 4 물. HCL로 산도 7.0으로 산도를 조정합니다. 0.1 % DEPC를 추가합니다. 밤이여 둡니다. 압력솥.
20x SSC 산도 7.0 (총 볼륨 : 일리터)
| 성분 | 볼륨 / 금액 | 최종 농도 |
| NaCl (58.44 g / 몰) | 175.32 g | 3 M NaCl |
| 나 구연 산염 (294.1 g / 몰) | 88.23 g | 0.300 M 나의 구연 산염 |
| MilliQ - 워터 | 최대 1리터로 | |
| HCL | 산도 7.5을 제공 | |
| DEPC | 1 ML | 0.1 % DEPC |
NaCl과 ~ 800 ML 물의 나의 구연 산염을 디졸브. HCL로 산도 7.0으로 산도를 조정합니다. 물로 1리터로 볼륨을 조정합니다. 0.1 % DEPC를 추가합니다. 밤이여 둡니다. 압력솥.
5 X TBE (볼륨 : 일리터)
| 성분 | 볼륨 / 금액 | 최종 농도 |
| 트리스 (121.14 g / 몰) | 54g | ~ 0.45 M 트리스 |
| 붕산 (61.83 g / 몰) | 27.5 g | ~ 0.45 M 붕산 |
| EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (372.24 g / 몰) | 3.7 g | ~ 0.01 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) |
| MilliQ - 워터 | 최대 1리터에 |
믹스 트리스, 붕소의 소산, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 물. 산도 ~ 8.3 있어야합니다. 사용하기 전에 1 X TBE로 희석.
10 × TE 산도 8.0 (트리스 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 볼륨 : 일리터)
| 성분 | 볼륨 / 금액 | 최종 농도 |
| 1 M 트리스 - CL, 산도 8.0 | 100 ML | 0.100 M 트리스 - CL |
| 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) pH8.0 | 100 ML | 0.050 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) |
| MilliQ - 워터 | 최대 1리터에 |
믹스 트리스, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 물. DEPC - 취급하지 마십시오. 압력솥.
NB! 트리스는 DEPC - 처리해서는 안됩니다! RNase가없는 분말을 사용하고 DEPC-treated/RNase-free MilliQ - 물로 희석.
1 M 트리스 - HCL pH는 7.5-9.5 (볼륨 500 ML)
| 성분 | 볼륨 / 금액 | 최종 농도 |
| 트리스 (121.14 g / 몰) | 60.57 g | 1 M 트리스 |
| MilliQ - 워터 | 최대 500 ML에 | |
| HCL | 산도 7.5을 제공 | |
| HCL | 산도 8.0을 제공 | |
| NaOH | 산도 9.5을 제공 |
DEPC - 처리된 물에 트리스를 디졸브. 원하는 산도 조절할 수 있습니다. 500 ML의 최종 볼륨을 조절할 수 있습니다. 압력솥.
NB! 트리스는 DEPC - 처리해서는 안됩니다! RNase가없는 분말을 사용하고 DEPC-treated/RNase-free MilliQ - 물로 희석.
NB! 분자 복제에서 (위 참조) HCL가 올바른 산도를 달성하는 데 필요한 얼마나 많은 집중 설명하는 테이블이 있습니다.
재료와 방법
현장 프로토콜은 상기와 영화에 표시됩니다. 이 특정 예제에서 사용되는 식물과 프로브의 여기 추가 정보가 설명되어 있습니다.
식물 재료와 실험 설계
피세아 아비 에스에서 남자 콘스 [L.] 카르스트. (노르웨이 스프루스) 웁살라, 스웨덴, 가을 2007 수집했습니다. 에이트 원뿔은에서 sectioned 및 섹션되었습니다각 콘은 각 치료에 사용되었습니다. 세 proteinase K의 농도는 테스트되었습니다, 1, 3 및 5 μg / μl 각 농도는 RNase 여부와 상관없이 치료를했다. RNase와 치료하지 슬라이드는 RNase 처리하는 동안 PBS에 남아 있었다. Arabidopsis thaliana의 [L.] Heynh. Brassica napus L.하고는 22 문화 챔버의 제어 조건 하에서 성장했다 ° C/18 ° C 주 / 야 온도와 16 H.의 photoperiod 꽃 꽃봉오리, 단계 0-10을 (단계는 스미스 5에 따라)이있는 젊은 inflorescences을 공부했다.
cRNA 프로브
총 RNA는 P.로부터 격리되었다 아비 에스 남성 원뿔은 이전 6 설명 및 A.에서 thaliana와 B. 제조업 자의 권장 사항에 따라 각각 TRIzol (Gibco BRL, 프레드릭, 메릴랜드, 미국)과 Qiagen RNeasy 플랜트 미니 키트 (Qiagen, 힐든, 독일)를 사용하여 napus. cDNA는 제조 업체의 지침에 따라 윗첨자 III 역방향 Transcriptase을 (Invitrogen, 칼스 배드, 캘리포니아, 미국)를 사용하여 종이에 따라 0.5-1 μg의 총 RNA,에서 합성되었다. AtAP3과 BnAP3 감각과 안티 센스 조각과 P.은 아비 에스 감각 조각을 격리합니다. DAL13 안티 센스 조각이 고립과 7에서와 같이 primers를 사용하여 증폭되었습니다 유전자 특정 primers (표 1)를 사용하여 증폭되었다. T7의 오버행은 A.의 조각에 추가되었습니다 thaliana와 P. T7 - 시퀀스 (표 1)을 가지고 수정 리버스 primers를 사용하여 아비 에스. 500 BP의 조각은 BnAP3 특정 primers를 (표 1)를 사용하여 절연하고 T7 - promotor와 pGEM - T 벡터에 복제되었습니다. P. 아비 에스의 모든 PCR 반응 각 20 μl 0.2 U의 Phusion를 포함하는 고속 Fidility의 DNA 중합 효소 (Finnzymes, 에스포, 핀란드), 1X Phusion HF 버퍼, 각 dNTP 200 μm의, 0.3 μm의의 최종 볼륨에서 수행되었다 조각 프라이머와 25-50 NG cDNA와 표준 PCR 프로그램은 온도 60-55 ° C (터치 다운 -1 ° C / 사이클) 55 ° C. 다음을 어닐링과 함께 사용되었다 제조 업체의 권고 사항과 긴 프로브에 따라 약 100-150 BP로 소화했고, 세 종족에 대한 감각과 안티 센스 cRNA 프로브는 발굴 RNA 라벨링 키트 (로체 응용 과학, 만하임, 독일 SP6/T7)를 사용하여 시험 관내 전사에서와 합성되었다 3 따라 나 2 CO 3 버퍼를 사용하여 조각.
결과
다음은 결과 섹션 우리는 현장 실험에서 전형적인 결과의 세 가지 다른 예제를 설명합니다.
지정 남성과 여성 기관 정체성에 의해 gymnosperms과 angiosperms의 생식 발달을 조절 유전자 메커니즘은 두 종자 식물 lineages가 2억8천5백만년 10 전에 별거 그럼에도 불구하고 진화 보존 7-9로 나타납니다. A에서 thaliana 꽃 homeotic 유전자 APETALA3 (AP3 11)와 PISTILLATA (PI 12) 필요한 꽃의 컨텍스트 내에서 남성의 생식 발전을 지정하기에 충분하며,이 기능은 13 혈통 angiosperm 내에서 보존되어야 나타납니다. 꽃 부족하고 생식 기관이 별도의 남성과 여성의 콘 (그림 1A - C), 유전자의 배열이 gymnosperms에서 동종에 AP3과 PI은 특히 남성 원추, microsporophylls 7,14의 꽃가루 베어링 기관에 표현됩니다. 따라서 angiosperms 및 gymnosperms 모두 상동 유전자의 비슷한 세트 꽃가루 베어링 기관을 정의합니다.
각각 AtAP3 및 BnAP3,에 대한 감독 진 구체적인 프로브는, 소용 돌 이꼴 두 해당 지역에서 젊은 꽃 꽃봉오리의 단계 3에서 신호와 A. 세 준 thaliana와 B. napus. 나중에 신호가 개발 꽃잎 및 stamens (그림 2A와 B)으로 제한했다 버즈 개최. 이러한 결과는 이전 연구 11,15,16 동의에 있습니다. P.에 AP3 homologue 향해 감독 프로브 아비 에스, DAL13는 P.의 microsporophylls에서 신호를 생산 아비 에스 남성 원뿔 모두 혀끝의 분열 조직 종료 전후 (그림 2C 및 D)로 이전의 연구 7,14 기대. 감지 프로브 배경 (그림 3A - B 및 데이터가 표시되지 않음) 이상의 신호를주지 않았다. 함께 촬영이 결과는 A. 표현을 보여주 thaliana의 AP3와 B 년에 orthologs napus와 P. 남성 생식 기관의 개발에 아비 에스.
그림 1. A.thaliana와 B. 침엽수 P.의 남성 원뿔 생산 napus 꽃과 화분 아비 그림 꽃 봉오리와 A.thaliana 및 B.napu의 열린 꽃 inflorescences 보여A와 B 각각의 S. 따로 멸균 꽃 덮개에서 angiosperm 꽃은 남성과 여성 모두 생식 기관을 비호하는 것에주의하라; stamens와 carpels. C로 표시하는 것은이 gymnosperm P.의 가지이다 녹색 식물 바늘과 빨간 생식 남성 원뿔과 아비 에스.
그림 2. A. 표현 thaliana의 AP3와 B의 상동 유전자 napus와 P. 아비 에스. Micrographs은 A.의 세로 부분을 표시 thaliana와 B. A와 B 각각와 P.에 napus inflorescences C와 D의 아비 에스 남성 콘스. 섹션 두 번째 및 세 번째 윤생체 플로랄 장기 B에 A와 BnAP3 쇼 신호에 AtAP3 향한 안티 센스 프로브와 함께 hybridized. 번호 스미스 5에 따라 꽃 단계를 나타냅니다. DAL13 유전자 향해 감독 안티 센스 프로브 P.의 꽃가루 베어링 microsporophylls에서 신호를 준 로 CD에 나타난 아비 에스 남성 콘스. microsporophylls의 예는 화살표로 표시됩니다. 하이브리드화 신호 AD 지점에 화살촉이, 어떤은 보라색 나타납니다. C와 D에 페놀 수지 carbon 화합물은 중앙 속의 개별 셀에 갈색 unspecific 색상을 제공합니다. S, 꽃받침 조각, P, 꽃잎, ST, 수술, C, 심피, MS, microsporophyll, 파이, 속, PP, 미리 화분 세포. 바 : 100 μm의.
P.에서 남성 원뿔 그림 3. DAL13 표현 아비 에스. 모든 Micrographs은 (AH), 혀끝의 분열 조직 종료 후 남성 원뿔의 종단 부분을 게재됩니다. 화살촉은 DAL13이 표현되는 세포 유형을 가리 킵니다. A와 B의 부분은 배경 얼룩을 결정하는 감각 제어 프로브와 함께 hybridized 있습니다. H에 Micrographs C는 DAL13의 안티 센스 프로브와 함께 hybridized 있습니다. RNase 치료와하지 않고 실험에서 제는 D, F, H 각각 C, E, G에 표시됩니다. 100 μm의 : 1 μg / ML proteinase K와 실험에서 Micrographs는 C와 D, 3 μg / E와 F의 ML, 5 G와 H. 표시줄에 μg / ML에 표시됩니다.
Discussion
P. 두 측면 아비 에스 프로토콜 A.에 비해 최적화되었습니다 thaliana / B. napus 프로토콜 RNase 처리 및 proteinase K의 농도. RNase 배경 신호를 제거하기 때문에 신호 특이성의 17 증가합니다. proteinase K 처리는 프로브 입력과 관심의 RNA 수영장에 잡종 수 있도록 조직을 permeabilize 필요합니다. DAL13 안티 센스 탐사선은 30 분 (그림 2D, F 및 H)의 RNase 취급 섹션에 비해 RNase - 치료 (그림 3C, E, G)없이 높은 신호를 주었다. RNase - 치료 신호를 강화하지 않았으므로 그것은 프로토콜에서 제거되었습니다. 1, 3 및 5 μg / ML, proteinase K 치료는 세 가지 다른 농도에서 테스트되었습니다. P.의 경우에는 낮은 또는 아니오 신호 아비 에스는 1 μg / ML proteinase K (그림 3C - D)를 사용하여 관찰되었다. 5 μg / ML proteinase K를 사용하면 강한 신호가 3 μg / ML (그림 3E - F), 5 μg / ML 모두 얻은 것입니다 (그림 3G - H) proteinase K.는 신호의 강도에 뚜렷한 차이가 있기 때문에 발견 3 μg / ML에 비해, 우리는 프로토콜 3 μg / ML을 사용하기로 결정했습니다. 그것은 가능성이 그 P.의 높은 proteinase K의 농도의 필요성 아비 에스 남성 원뿔은 A. 비교 thaliana와 B. napus 꽃 꽃봉오리는 phenolics와 다당류의 높은 수준과 더 컴팩트한 조직에 의한 것입니다.
고정 동안과 A. 사이의 차이를 삽입 thaliana / B. napus 프로토콜과 P. 아비 에스 프로토콜은 분명합니다. 관심의 조직은 RNA 보존을 제공하는 고정하고 제대로 고정 재료는 mRNA가 매우 풍부에도 불구하고 낮은 또는 탐지 신호를 줄 수 있으므로 이것은 중요한 단계입니다. 조직 취소 및 조직 손상을 방지하기 위해 점진적 변화의 왁스에 포함된, 건조하고, 어떤 프로토콜을 0.85 % NaCl에서 추가 전지 3 수축과 팽창을 피하기 위해 탈수의 에탄올에 추가됩니다. 퍼가기 동안 탈수 단계는 최소한 RNase 활동을 유지하기 위해 얼음을 수행할 수 있습니다. P. 년 아비 에스 프로토콜 4 % paraformaldehyde의 해결책 일부는 아마도 아무런 차이 3도하지 않습니다 주장되는 경우에도 더 나은 RNA 보존 17를 제공하도록되어 0.25 %의 글루 타 알데히드를 포함하고 있습니다. 자료를 sectioning 후 하이브리드화 이전 (비 특정 프로브의 결합 그리고 마침내 탈진을 줄이기 위해 치료 permeabilized rehydrated 즉 dewaxed,,,) 슬라이드에 고정하고 pretreated입니다.
여기에 제시된 프로토콜 전체 검색 절차가 일반적인 실험실에서 수행할 수, 신호 1-3 일 이내 개발 및 배경을 통해 신호 간의 비율을 지속적으로 모니터링할 수 있습니다. 디그 - 라벨이 프로브는 일반적으로 방사능 표시 프로브에 비해,보다 뚜렷한 신호를보다 안정되고 연속 실험에 활용할 수 있습니다. 반면에, 감도는 방사성 프로브 17에 비해 줄일 수있다. 원위치 하이브리드화에서는 특정 mRNA의 특정 라벨 프로브를 사용하여 표현을 감지합니다. 라디오 레이블은 강력하고 민감한 분류 방법입니다하지만 방사능의 처리가 필요하며 그 결과가 감지되기 전에는 몇 주 정도 소요됩니다. 한편 항원 - 라벨 프로브는 덜 위험한,보다 안정되고 겨우 17 몇 일 동안 검색 매체 노출을 필요로합니다. 따라서 항원 라벨링 방법은 현재 지배하고 있습니다. 에 관계없이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 프로브 디자인입니다. 케어는 탐사선이 높은 특이성을 가지고 있으며, 양질의 UTPs로 분류되어 있는지 확인하십시오로 이동해야합니다. 가끔 하이브리드화 온도 및 / 또는 반응 길이는 특정 프로브에 따라 조정해야합니다.
디그 - 라벨 프로브에 따라 우리 수정된 프로토콜 A. 이르기까지 종 동시에 mRNA의 표현의 지방화를 촉진합니다 P.로 thaliana 아비 에스, 그리고 약간의 조정 다른 식물 종을에서 사용할 수 있어야합니다. 프로토콜은 남성 콘 옆에도 식물 쏘고의 다른 단계와 P.부터 접합자의와 체세포 배아 모두에서 테스트되었습니다 좋은 결과 (.; Karlgren 외 미발표 결과)와 아비 에스.
Disclosures
저자는 공개 없어요.
Acknowledgments
우리는 스피커 음성으로 자원 봉사를위한 영화 음악을 제공 앤더스 보빈과 마이클 엘리엇 주식 매우 감사하고 있습니다. 지원 칼 Trygger 재단, 농업 과학, 스웨덴 연구 협의회 (VR)의 스웨덴의 대학에서 전략적 연구 프로그램 농업 기능성 유전체학 (AgriFunGen), 그리고 환경에 대한 스웨덴 연구 협의회, 농업 과학, 그리고 공간 계획 (FORMAS에 의해 제공된 ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic anhydride | Sigma-Aldrich | A6404-200ml | minimum 98% |
| Acrylamide, linear | Ambion | 9520 | |
| Anti-DIG-antibodies | Roche Group | ||
| Blocking reagent | Roche Group | 11 175 041 910 or 11 096 176 001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030-50g | minimum 98% |
| Deionized formamide | Sigma-Aldrich | ||
| Denhardts solution | Sigma-Aldrich | D2532-5ml | |
| DEPC, diethylpyrocarbonate | Sigma-Aldrich | ||
| Dextran sulfate | Sigma-Aldrich | ||
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Roche Group | 11175025910 | |
| Glutaraldehyde (25%) | Histolab | ||
| Glycogen | Ambion | 9510G | |
| Histoclear II | Histolab | You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue. | |
| Histowax | Histolab | Histowax or Paraplast can be used for embedding. | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500g | |
| Paraplast plus | Sigma-Aldrich | P3683-1kg | Histowax or Paraplast can be used for embedding. |
| Phusion™ High-Fidility DNA Polymerase | Finnzymes | ||
| Probe-on Plus slides | Fisher Scientific | 22-230-900 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-5mg | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R5503-100mg | |
| Tissue-clear | Sakura Finetek | You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue. | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | T1377-100ml | minimum 98% |
| Triton X-100 | use your standard product in the lab | Use one or both of Triton X-100 and Tween-20. | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 83853-100mg | |
| Tween-20 | use your standard product in the lab | Use one or both of Triton X-100 and Tween-20. | |
| Western Blue | Promega Corp. |
References
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