Summary
इस अनुच्छेद में हम खमीर माँ कोशिकाओं के replicative जीवन अवधि को मापने के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल उपस्थित थे.
Abstract
उम्र बढ़ने के एक अपक्षयी प्रक्रिया सेलुलर घटकों और मृत्यु दर में जिसके परिणामस्वरूप organelles के एक प्रगतिशील गिरावट के द्वारा विशेषता है. नवोदित खमीर
Protocol
भाग 1: replicative जीवन काल विश्लेषण के लिए उपभेदों और प्लेटें तैयार
यह खंड replicative जीवन काल प्रयोग और जीवन काल के विश्लेषण के लिए खमीर कोशिकाओं की तैयारी में इस्तेमाल के लिए ठोस YEPD प्लेटों की तैयारी का वर्णन है.
- उपयुक्त बाँझ तकनीक का प्रयोग, YEPD अगर (1% खमीर निकालने, 2% bacto - peptone, अगर 2%, 2% ग्लूकोज) प्लेटें कि संवर्धन खमीर कोशिकाओं के लिए और replicative जीवन काल के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा तैयार. आप हर 4-5 के जीवन काल प्रयोग में विश्लेषण किया जा उपभेदों के लिए कम से कम 2 प्लेटें तैयार करना चाहिए. प्लेट्स कम से कम 2 दिनों के जीवन काल के प्रयोग से पहले होने के लिए तैयार करना चाहिए और जीवन काल परख शुरुआत से पहले सूखे की अनुमति दी. यदि प्रयोग प्लेटों डालने का कार्य के 4-5 दिनों के भीतर शुरू नहीं होगा, वे एक प्रशीतित इनक्यूबेटर में रखा होना चाहिए और parafilm में लिपटे या dessication रोकने के प्लास्टिक.
- खमीर उपभेदों YEPD अगर प्लेटों पर एकल कालोनियों के लिए जमे हुए स्टॉक और लकीर से निकालें. 6 उपभेदों के लिए आसानी से समान रूप से आकार पाई के आकार wedges में थाली विभाजन करके एक ही YEPD थाली पर रेखादार हो सकता है.
- 30 ° C पर 2 दिनों के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
- एक ताजा YEPD थाली पर इनक्यूबेटर और एक एकल कॉलोनी से पैच कोशिकाओं कोशिकाओं से निकालें. प्रत्येक तनाव के लिए दो अलग अलग कालोनियों से दो पैच में उत्पन्न किया जाना चाहिए. इस समय, उपभेदों के लिए विश्लेषण किया जा करने के लिए सुनिश्चित करें replicative जीवन काल "अंधा" प्रयोग किया जाता है, जहां dissectors अलग - अलग उपभेदों के पहचान नहीं पता है कोडित किया जाना चाहिए.
- बाद शाम तक 30 में समझौता, कोडित कोशिकाओं ° सी सेते हैं.
- कोशिकाओं और प्रत्येक कोडित तनाव से हल्के पैच कोशिकाओं ताजा YEPD प्लेटों के लिए, जो प्रयोगात्मक replicative जीवन काल के विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता प्लेटों के रूप में काम करेगा निकालें. कक्ष YEPD प्लेट (चित्रा 1) के बाईं ओर पर एक खड़ी रेखा के साथ समझौता किया जाना चाहिए. प्लेट प्रति 3-5 पैच लगभग इष्टतम है, हर पैच से 20 कोशिकाओं पर replicative जीवन काल विश्लेषण संभालने. यह आवश्यक नहीं है (और न ही वांछनीय) ताजा YEPD थाली करने के लिए कक्षों की एक बड़ी संख्या के हस्तांतरण के रूप में इस कोशिकाओं घनी रात भर ऊष्मायन, जो उनके बाद replicative जीवन अवधि को सीमित कर सकता है के दौरान विकसित करने के लिए कारण होगा.
- हौसले से समझौता बेंच शीर्ष पर रातोंरात प्लेटें सेते हैं.
भाग 2: replicative जीवन अवधि विश्लेषण के लिए स्थिति की कोशिकाओं.
हम इस अनुभाग में वर्णन कैसे थाली पर खमीर कोशिकाओं और replicative जीवन काल विश्लेषण के लिए कुंवारी बेटी कोशिकाओं प्राप्त करने के लिए कैसे की स्थिति के लिए. पर इस बिंदु से, सभी प्लेटें जब विच्छेदन के दौर से गुजर छोड़कर, parafilmed चाहिए, क्रम में dessication को रोकने.
- एक microdissection खमीर के लिए उपयुक्त उपकरण के साथ सुसज्जित सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, समझौता कोशिकाओं को बाहर का प्लेट पर एक स्थिति के लिए पहले समझौता तनाव से लगभग 50 कोशिकाओं हस्तांतरण. यदि आपके खुर्दबीन चरण में वर्गीकृत है, इन gradations कोशिकाओं बाद पुनरावृत्तियों के दौरान खोजने के लिए आसान हो जाएगा करने के लिए सुनिश्चित करें के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Zeiss 40 Axioscope में पहला समझौता तनाव से कोशिकाओं निर्देशांक 90 x 10 में रखा जा सकता है और वहाँ से खड़ी arrayed.
- बार बार अगर सतह को छू द्वारा कोशिकाओं की सुई साफ़ है, तो अगर सतह के माध्यम से सुई मजबूर द्वारा अगर में एक छेद बना. यह छेद आप उन्मुख करने के लिए एक मार्कर के रूप में की थाली पर विच्छेदन और बेटी सेल को हटाने के बाद पुनरावृत्तियों के दौरान सेवा करेंगे. छेद में खमीर कोशिकाओं नहीं मिलता है, या वे विकसित होगा और एक कॉलोनी के रूप में सावधान रहें.
- छेद सीधे ऊपर, प्रत्येक कक्ष की स्थिति (चित्रा 1) के बीच 1-3 सुई व्यास (~ 100 सुक्ष्ममापी) के साथ खड़ी 20 समान रूप से स्थान स्थिति में व्यक्ति खमीर कोशिकाओं, संरेखित करें. हर कुछ कोशिकाओं, के बजाय एक लाइन में एक ही स्थिति में दोनों एक दूसरे के सन्निकट कक्षों जगह है. यह कुंवारी बेटी सेल चयन के दौरान अतिरेक के लिए अनुमति देता है, अगर हस्तांतरित कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए विफल रहता है.
- 10 वीं और लाइन में 11 वें पदों के बीच, अगर में 7-8 छेद के एक क्षैतिज श्रृंखला बनाने के लिए. इस विच्छेदन और बेटी सेल को हटाने के बाद पुनरावृत्तियों के दौरान थाली पर आप उन्मुख करने के लिए एक मार्कर के रूप में सेवा करेंगे. छेद में खमीर कोशिकाओं को नहीं मिलता, या वे विकसित होगा और एक कॉलोनी के रूप में सावधान रहें.
- दोहराएँ चरण थाली पर हर पैच के लिए 2.1-2.4, सरणी कोशिकाओं को एक ही अक्ष के साथ खड़ी सतत. 2.2 कदम के लिए बनाई गई छेद की संख्या पैच संख्या (पहला पैच के लिए एक छेद, दूसरे के लिए दो छेद, आदि) के अनुरूप होना चाहिए.
- एक बार कोशिकाओं के हर पैच के लिए arrayed है, parafilm थाली और 30 पर सेते डिग्री सेल्सियस लगभग 2 घंटे के लिए.
- दोहराएँ प्रत्येक प्लेट के लिए प्रयोग में 2.1-2.6 कदम.
भाग 3: जीवन अवधि के विश्लेषण के लिए प्राप्त कुंवारी बेटी कोशिकाओं
इस अनुभाग में हम सुनिश्चित करने के द्वारा जीवन काल विश्लेषण आरंभ कि प्रत्येक कोशिका एक कुंवारी बेटी के रूप में शुरू होता हैसेल.
- इनक्यूबेटर से प्लेटें निकालें और सत्यापित करें कि arrayed कोशिकाओं के अधिकांश एक कोशिका विभाजन आया है. यदि अतिरिक्त समय कोशिका विभाजन पूरा होने की अनुमति की जरूरत है, मशीन के लिए थाली वापसी.
- पहले arrayed सेल के साथ शुरू, सुई का उपयोग करने के लिए धीरे संलग्न कोशिकाओं के शीर्ष पर सुई रखकर सेल से मां बेटी कोशिकाओं को अलग. यह कभी कभी उपयोगी है खुर्दबीन आधार की ओर नल जबकि सुई कोशिकाओं पर आराम कर रहा है.
- ऊर्ध्वाधर पंक्ति में अलग बेटी सेल, माँ सेल और किसी भी अतिरिक्त बेटी कोशिकाओं की जगह और उन्हें अस्थायी रूप से चलती अलग रखें.
- दोहराएँ arrayed कोशिकाओं में से प्रत्येक के लिए 3.2 और 3.3 कदम. यदि किसी कक्ष को विभाजित करने में विफल रहता है, बेमानी 2.3 कदम में तैनात कोशिकाओं से एक बेटी सेल ले. जब समाप्त हो, तो आप प्रत्येक जीवन काल की थाली पर खड़ी गठबंधन पैच के लिए 20 बेटी कोशिकाओं होना चाहिए.
- माँ एक ढेर में और कोशिकाओं को अतिरिक्त बेटी कोशिकाओं के सभी लीजिए और पैच के पास एक क्षेत्र ("कब्रिस्तान") के लिए उन्हें वापस हस्तांतरण. यह microcolonies और स्थानीय पोषक तत्वों की कमी के गठन को रोकने के जीवन काल विश्लेषण के दौर से गुजर कोशिकाओं से दूर अवांछित कोशिकाओं रखना महत्वपूर्ण है.
- Parafilm थाली और 30 पर सेते डिग्री सेल्सियस लगभग 2 घंटे के लिए.
- दोहराएँ प्रत्येक प्लेट के लिए प्रयोग में 3.2-3.6 कदम.
भाग 4: व्यक्ति की कोशिकाओं के replicative मापने की क्षमता
- जीवन काल डाटा शीट तैयार. एक जीवन काल डाटा शीट जहां प्रत्येक पंक्ति एक व्यक्ति माँ सेल के लिए मेल खाती है और प्रत्येक स्तंभ एक बिंदु उम्र (चित्रा 2) से मेल खाती है है एक सरल ग्रिड जा सकता है. विश्लेषण किया जा उपभेदों की संख्या के अनुसार प्रत्येक डेटा पत्रक लेबल.
- इनक्यूबेटर से प्लेटें निकालें और सत्यापित करें कि arrayed कोशिकाओं के सबसे कम से कम एक कोशिका विभाजन आया है. यदि अतिरिक्त समय कोशिका विभाजन पूरा होने की अनुमति की जरूरत है, मशीन के लिए थाली वापसी.
- पहली प्लेट पर पहले arrayed सेल के साथ शुरुआत, नेत्रहीन माँ और बेटी सेल (ओं) का पालन हुआ है कि कोशिका विभाजन की संख्या का निर्धारण. आमतौर पर यह निर्धारित करने के लिए आसान है एक माँ कितने बेटी कोशिकाओं का उत्पादन किया गया है, सेल व्यवस्था की विशेषता पैटर्न पर आधारित है. बेटी के जीवन काल स्कोर शीट पर उपयुक्त बॉक्स में माँ सेल द्वारा उत्पादित कोशिकाओं की संख्या रिकार्ड.
- सुई का प्रयोग माँ के रूप में 3.2 चरण में वर्णित सेल से बेटी की कोशिकाओं को अलग.
- माँ सेल में खड़ी रेखा में अपनी स्थिति बनाए रखने और बेटी सेल (ओं) को अस्थायी रूप से सरकाना.
- दोहराएँ चरण arrayed कोशिकाओं में से प्रत्येक के लिए 4.3-4.5.
- त्याग बेटी कोशिकाओं के सभी ले लीजिए और उन्हें 'कब्रिस्तान' मूल पैच के निकट स्थित करने के लिए कदम.
- Parafilm थाली और पर 30 सेते ° सी 2-3 घंटे के लिए.
- दोहराएँ प्रत्येक प्लेट के लिए प्रयोग में 4.3-4.8 कदम.
- दोहराएँ 4.2-4.9 कदम जब तक सभी माँ कोशिकाओं को विभाजित बंद कर दिया है. माँ कोशिकाओं की उम्र के रूप में, कोशिका चक्र प्रगति धीमी हो जाता है और यह वांछनीय हो सकता है उम्र बिंदुओं के बीच समय की लंबी अवधि के लिए थाली सेते. प्लेट्स 4 डिग्री सेल्सियस रात भर रखा जा सकता है.
भाग 5: प्रतिनिधि परिणाम.
एक replicative जीवन काल प्रयोग द्वारा उत्पादित कच्चे डेटा एक सूची बेटी प्रत्येक बिंदु उम्र (चित्रा 2) प्रत्येक माँ सेल द्वारा उत्पादित की कोशिकाओं को इसी संख्या है. स्कोर पत्रक के प्रत्येक पंक्ति संक्षेप करके, प्रत्येक माँ सेल के लिए replicative जीवन काल प्राप्त की है. ही प्रायोगिक समूह से माँ की कोशिकाओं के लिए डेटा के लिए अस्तित्व की अवस्था (चित्रा 3A) उत्पन्न करने के लिए और मतलब जीवन काल, औसत जीवन अवधि, और मानक विचलन के रूप में सांख्यिकीय गणना, प्रदर्शन करने के लिए जमा किया जा सकता है. Wilcoxon परीक्षण दरजा - योग जैसे एक गैर पैरामीट्रिक परीक्षण, यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि जीवन काल में महत्वपूर्ण मतभेद प्रयोगात्मक समूहों के बीच पाया गया. जब प्रयोग सही ढंग से काम करता है, अस्तित्व वक्र मोटे तौर पर Gompertz - Makeham कम जल्दी मृत्यु दर के साथ एक sigmoidal shap दिखा कैनेटीक्स के साथ संगत होना अस्तित्व में एक अपेक्षाकृत तेजी से गिरावट आई और वक्र के सपाट बाहर एक बाद उम्र का पालन करना चाहिए. सबसे जंगली प्रकार उपभेदों 20-30 पीढ़ी रेंज में replicative जीवन काल मान है, हालांकि इस श्रृंखला के विभिन्नता बाहर बताया गया है.
चित्रा 1. एक ठेठ replicative जीवन काल प्लेट का आरेख. खमीर कोशिकाओं के microdissection शुरू होने से पहले शाम, 3-5 उपभेदों हल्के से थाली के एक पक्ष के साथ एक ऊर्ध्वाधर पंक्ति में एक YEPD प्लेट (लाल बक्से) की सतह पर समझौता. रातोंरात वृद्धि के बाद, लगभग 30 प्रत्येक तनाव से व्यक्ति की कोशिकाओं खड़ी 20 पदों युक्त लाइन में arrayed रहे हैं. जीवन अवधि analysiएस v कुंवारी बेटी इन प्रारंभिक कोशिकाओं से प्राप्त कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया जाएगा. प्रयोग (जैसे अवांछित बेटी कोशिकाओं) के दौरान अतिरिक्त microdissection से प्राप्त कोशिकाओं "कब्रिस्तान" (ग्रे अंडाकार) है, जो प्रयोगात्मक कोशिकाओं से दूर स्थित है क्रम में पोषक तत्वों की स्थानीय रिक्तीकरण कालोनियों का गठन कर रहे हैं से बचने में रखा जाता है.
चित्रा 2. एक replicative जीवन काल प्रयोग से एक replicative जीवन काल मिलान पत्रक कच्चे डेटा से पता चला है. प्रत्येक पंक्ति एक एकल खमीर माँ सेल से मेल खाती है और प्रत्येक स्तंभ एक उम्र बिंदु से मेल खाती है है. प्रत्येक बॉक्स में दर्ज संख्या बेटी कि माँ सेल द्वारा उत्पादित कि उम्र के बिंदु पर कोशिकाओं की संख्या है. प्रत्येक तनाव एक कोडित ऐसी है कि खमीर कोशिकाओं विदारक व्यक्ति विश्लेषण किया जा रहा उपभेदों की पहचान का ज्ञान नहीं है संख्या के साथ लेबल है. प्रत्येक तनाव के लिए बीस कोशिकाओं assayed हैं.
चित्रा 3. प्रतिनिधि अस्तित्व और एक replicative जीवन काल प्रयोग से विकास घटता (ए) जीवन रक्षा घटता माँ replicative उम्र के एक समारोह के रूप में अभी भी जिंदा (सेल डिवीजनों की संख्या. कोशिकाओं के अंश की साजिश रचने के द्वारा प्राप्त कर रहे हैं (बी) ग्रोथ घटता साजिश रचने के द्वारा प्राप्त कर रहे हैं. बेटी कोशिकाओं उम्र बिंदु के एक समारोह के रूप में एक भी तनाव के द्वारा उत्पादित की औसत संख्या. इस उदाहरण में, # 2 तनाव अब रहता है, लेकिन धीमी गति बढ़ रही है, के रूप में वृद्धि साजिश के कम प्रारंभिक ढलान द्वारा evidenced है.
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Acknowledgments
इस काम एलिसन मेडिकल फाउंडेशन से एम.के. और BKK के लिए एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. एम के एक एलिसन एजिंग में मेडिकल फाउंडेशन नई विद्वान है. हम सहायता के लिए शूटिंग के दौरान सौम्या Kotireddy धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Reagent | Fisher Scientific | DF0145-17-0 (214530) | |
| Bacto-Peptone | Reagent | Fisher Scientific | DF0118-17-0 (211677) | |
| Yeast Extract | Reagent | Fisher Scientific | DF0886-17-0 (288620) | |
| Glucose |
References
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