Mätning Span replikationsförmåga Livet i den spirande Jäst

Summary

I denna artikel presenterar vi en allmän protokoll för att mäta span replikationsförmåga liv jästceller mor.

Abstract

Åldrande är en degenerativ process som kännetecknas av en progressiv försämring av cellulära komponenter och organeller resulterade i dödlighet. Den spirande jäst

Protocol

Del 1: Förbered stammar och plattor för replikationsförmåga livslängd analys

Detta avsnitt beskriver förberedelserna av det fasta YEPD plattorna för användning i replikationsförmåga livslängd experiment och beredning av jästceller för livslängd analys.

1. Använda lämplig steril teknik, förbereda YEPD agarplattor (1% jästextrakt, 2% Bacto-pepton, 2% agar, 2% glukos) som kommer att användas för celler odling jäst och för replikationsförmåga livslängd analys. Du ska förbereda åtminstone 2 plattor för varje 4-5 stammar som skall analyseras i livslängd experimentet. Plattor bör beredas minst 2 dagar före livslängd experiment och får torka innan analysen livslängd. Om försöket inte kommer att inledas inom 4-5 dagar hälla tallrikar, bör de placeras i en kyld inkubator och insvept i parafilm eller plast för att förhindra uttorkning.
2. Ta bort jäststammar från fryst lager och strimmig för enstaka kolonier på YEPD agarplattor. Upp till 6 stammar kan lätt strimmiga på samma YEPD plattan genom att dela plattan i lika stora pie-formade kilar.
3. Inkubera cellerna vid 30 ° C i 2 dagar.
4. Ta bort celler från inkubatorn och celler patch från en enda koloni på en ny YEPD tallrik. Två lappar från två olika kolonier ska skapas för varje stam. Vid denna tid bör stammar som skall analyseras kodas för att garantera replikationsförmåga livslängd experiment utförs "blind", där dissectors inte vet identiteten på enskilda stammar.
5. Inkubera lappade, kodade celler vid 30 ° C tills kvällen därpå.
6. Ta bort celler och lätt celler lapp från varje kodade stam till frisk YEPD plattor, som kommer att utgöra den experimentella plattor används för replikationsförmåga livslängd analys. Celler bör lagas längs en vertikal linje på vänster sida av YEPD plattan (Figur 1). Cirka 3-5 lappar per platta är optimal, förutsatt replikationsförmåga analys livslängd på 20 celler från varje patch. Det är inte nödvändigt (eller önskvärt) att överföra ett stort antal celler till friska YEPD plattan, eftersom detta gör att cellerna att växa tätt under natten inkubation, vilket kan begränsa deras senare span replikationsförmåga liv.
7. Inkubera nyligen lappat plattorna på bänken toppen.

Del 2: Position celler för replikationsförmåga livslängd analys.

I detta avsnitt beskriver vi hur du kan placera jästceller på tallriken och hur man får jungfrun dottern celler för replikationsförmåga livslängd analys. Från och med nu ska alla plattorna parafilmed, utom när genomgår dissektion, för att förhindra uttorkning.

1. Med hjälp av mikroskop utrustat med en microdissection apparater som är lämpliga för jäst, för över ungefär 50 celler från de första patchade stammen till en position på plattan distalt om lappade cellerna. Om din mikroskop skede bedöms, kan dessa graderingar användas för att säkerställa att cellerna blir lätt att hitta vid senare iterationer. På Zeiss Axioscope 40, kan cellerna från den första patchade stam placeras på koordinater 90 x 10 och klädd vertikalt därifrån.
2. Rengör nålen av celler genom att upprepade gånger vidröra agarytan, sedan skapa ett hål i agar genom att tvinga nålen genom agarytan. Detta hål kommer att fungera som en markör för att orientera dig på plattan under efterföljande iterationer av dissektion och dotter cellen tas bort. Var noga med att inte få jästceller i hålet, eller kommer de att växa och bilda en koloni.
3. Direkt ovanför hålet, vertikalt anpassa enskilda jästceller i 20 jämnt fördelade positioner, med 1-3 nål diameter (~ 100 mikroM) mellan varje cell läge (Figur 1). Med några celler, placera två celler intill varandra i samma position i kön snarare än ett. Detta möjliggör för övertalighet under jungfrun dottern cellmarkeringen, om en av de överförda cellerna inte dela sig.
4. Mellan ^{10: e} och ^{11: e} position i raden, skapa en horisontell serie av 7-8 hål i agar. Detta kommer att fungera som en markör för att orientera dig på plattan under efterföljande iterationer av dissektion och dotter cellen tas bort. Var noga med att inte få jästceller i hålen, eller kommer de att växa och bilda en koloni.
5. Upprepa steg 2,1-2,4 för varje patch på tallriken, fortsätter samling celler vertikalt längs samma axel. För steg 2,2, bör antalet skapade hål motsvarar patch nummer (ett hål för det första plåstret, två hål för den andra osv.)
6. När cellerna har varit klädd för varje patch, plattan och inkubera vid 30 parafilm ° C i ca 2 timmar.
7. Upprepa steg 2,1-2,6 för varje platta i försöket.

Del 3: Skaffa jungfru dotter celler för livslängd analys

I detta avsnitt har vi inleda analysen livslängd genom att se till att varje cell börjar som en jungfru dottercellen.

1. Ta ut plåtarna ur kuvösen och kontrollera att de flesta klädd cellerna har genomgått en celldelning. Om ytterligare tid behövs för att celldelningen skall fyllas tillbaka plattan i inkubatorn.
2. Från och med den första klädd cell använder nålen att lossna dotter celler från mamman cellen genom att försiktigt placera nålen på toppen av den bifogade celler. Det är ibland bra att peka på sidan av mikroskopet basen medan nålen vilar på cellerna.
3. Placera fristående dotter cell i vertikal linje, som ersätter modercellen och eventuella ytterligare celler dotter och flytta dem tillfälligt åt sidan.
4. Upprepa steg 3,2 och 3,3 för varje klädd celler. Om en cell inte dela, ta en dotter cell från en av de uppsagda cellerna placeras i steg 2,3. När du är klar bör du ha 20 dottern celler för varje patch linje vertikalt på livslängd plattan.
5. Samla alla moderns celler och extra celler dotter i en hög och överföra dem till ett område nära fläckar ("kyrkogården"). Det är viktigt att hålla oönskade celler långt från de celler som genomgår analys livslängd för att förhindra bildning av microcolonies och utarmning av lokala näringsämnen.
6. Parafilm plattan och inkubera vid 30 ° C i ca 2 timmar.
7. Upprepa steg 3,2-3,6 för varje platta i försöket.

Del 4: Mätning av replikationsförmåga av enskilda celler

1. Förbered livslängd datablad. En livslängd datablad kan vara en enkel rutnät där varje rad motsvarar en enskild mamma cell och varje kolumn motsvarar en ålder-punkt (Figur 2). Märk varje datablad enligt antalet stammar som ska analyseras.
2. Ta ut plåtarna ur kuvösen och kontrollera att de flesta klädd cellerna har genomgått minst en celldelning. Om ytterligare tid behövs för att celldelningen skall fyllas tillbaka plattan i inkubatorn.
3. Från och med den första klädd cellen på första plattan, visuellt observera mor och dotter cell (er) och fastställa antalet celldelningar som har inträffat. Det är i allmänhet lätt att avgöra hur många avkommor en mamma har producerat, baserat på karakteristiska mönster av cell arrangemang. Registrera antalet avkommor som produceras av modercellen i lämplig ruta på livslängden matchprotokollet.
4. Använd nål för att lösgöra dotter celler från mamman cellen som beskrivs i steg 3,2.
5. Behåll modercellen i sin position på den vertikala linjen och flytta dottern cellen (s) att tillfälligt åt sidan.
6. Upprepa steg 4,3-4,5 för varje klädd celler.
7. Samla alla kasserade dottern cellerna och flytta dem till "kyrkogård", som ligger nära den ursprungliga fläckar.
8. Parafilm plattan och inkubera vid 30 ° C i 2-3 timmar.
9. Upprepa steg 4,3-4,8 för varje platta i försöket.
10. Upprepa steg 4,2-4,9 tills alla moderns celler har slutat dela sig. Som mor cellerna ålder, blir cellcykelreglering långsammare och det kommer att vara önskvärt att inkubera plattan för längre perioder mellan ålder-poäng. Plattorna kan placeras vid 4 ° C över natten.

Del 5: representativa resultat.

Den rådata som produceras av en replikationsförmåga livslängd experiment är en lista nummer som motsvarar dotter celler som varje mor-cell vid varje ålder-punkt (Figur 2). Genom att summera varje rad i matchprotokollet är replikationsförmåga livslängden för varje modercellen erhållits. Data för mamman celler från samma experimentella gruppen kan slås samman för att skapa en överlevnad kurva (Figur 3A) och att utföra statistiska beräkningar, som betyder livslängd, median livslängd, och standardavvikelse. En icke-parametriska test, exempelvis Wilcoxon rank-sum test kan göras för att fastställa om signifikanta skillnader i livslängd upptäcktes mellan experimentella grupper. När experimentet fungerar korrekt, bör överlevnad kurvan ungefär överens med Gompertz-Makeham kinetik visar en sigmoidal Shap med låg tidig dödlighet följde en relativt snabb nedgång i överlevnad och en utplaning av kurvan senare åldrar. De flesta vildtyp stammar har replikationsförmåga värden livslängd på 20-30 generationen utbud, även om variationen utanför detta intervall har rapporterats.

Figur 1. Skiss av en typisk replikationsförmåga livslängd plattan. Kvällen innan microdissection av jästceller, är 3-5 stammar lätt lappade på ytan av en YEPD platta (röda lådor) i en vertikal linje längs ena sidan av plattan. Efter en tillväxt över en natt, är cirka 30 enskilda celler från varje stam klädd vertikalt i en rad som innehåller 20 positioner. Livslängd analysiar kommer att utföras på v jungfru dotter celler från dessa inledande celler. Extra celler från microdissection under försöket (t ex oönskad dotter celler) placeras i "kyrkogården" (grå oval), som ligger långt från den experimentella celler för att undvika lokal utarmning av näringsämnen som kolonier bildas.

Figur 2. En replikationsförmåga livslängd stämmer ark. Rådata från en replikationsförmåga livslängd experiment visas. Varje rad motsvarar en enskild jäst mamma cell och varje kolumn motsvarar en ålders-punkt. Antalet in i varje ruta är antalet avkommor som produceras av att mor cellen i den åldern-punkten. Varje stam är märkt med ett kodat nummer så att den enskilde dissekera jästcellerna har ingen kännedom om identiteten på de stammar som analyseras. Tjugo celler analyseras för varje stam.

Figur 3. Representant överlevnad och kurvor tillväxt från en replikationsförmåga livslängd experiment. (A) överlevnadskurvorna erhålls genom att plotta bråkdel av moderns celler lever som en funktion av replikationsförmåga ålder (antal celldelningar. (B) Tillväxt kurvor erhålls genom att plotta genomsnittliga antalet avkommor som produceras av en viss stam som funktion av ålder-punkten. I det här exemplet är stam # 2 längre livslängd, men är långsammare växer, vilket framgår av den minskade initiala lutningen på tillväxt tomten.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Reagent	Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
Bacto-Peptone	Reagent	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
Yeast Extract	Reagent	Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)
Glucose