Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा Zebrafish भ्रूण मस्तिष्क की इमेजिंग लाइव

Summary

इस वीडियो में, हम एक विधि जिसके द्वारा confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा एकल कक्ष संकल्प पर रहते zebrafish भ्रूण में विकसित हड्डीवाला मस्तिष्क का विश्लेषण करने के लिए प्रदर्शित करता है. यह विधि है जिसके द्वारा हम zebrafish एकल कोशिका भ्रूण इंजेक्षन और बाद में माउंट और छवि विकासशील मस्तिष्क भी शामिल है.

Abstract

इस वीडियो में, हम हमारी प्रयोगशाला विधि सेल आकार में परिवर्तन और rearrangements मोड़ और विकासशील zebrafish मस्तिष्क (Gutzman एट अल, 2008) गुना करने की आवश्यकता का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया है प्रदर्शित करता है. इस तरह के विश्लेषण अंतर्निहित कक्ष हड्डीवाला मस्तिष्क के 3D संरचना के विकास के लिए आवश्यक जीव विज्ञान की एक नई समझ देता है, और काफी हमारे न्यूरल ट्यूब morphogenesis अध्ययन करने की क्षमता बढ़ जाती है. भ्रूण zebrafish मस्तिष्क neuroepithelium बढ़ भीतर निलय के रूप में 18 घंटे पोस्ट निषेचन (HPF) पर शुरुआत करने के लिए आकार का है. 24 HPF करके, न्यूरल ट्यूब morphogenesis के प्रारंभिक चरणों को पूरा कर रहे हैं. पद्धति का उपयोग करके यहाँ वर्णित है, एक सेल स्तर पर भ्रूण mRNA एन्कोडिंग झिल्ली लक्षित हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (memGFP) के साथ अंतःक्षिप्त रहे हैं. घुड़सवार, इंजेक्शन और ऊष्मायन, भ्रूण, 18 और 24 के बीच अब HPF के बाद, है उलटा, agarose में और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged. विशेष रूप से, zebrafish भ्रूण पारदर्शी है यह फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए एक आदर्श प्रणाली बनाने. जबकि हमारे विश्लेषण सीमा midbrain hindbrain और hindbrain पर ध्यान केंद्रित किया है, इस विधि 80-100 सुक्ष्ममापी की गहराई zebrafish में किसी भी क्षेत्र के विश्लेषण के लिए बढ़ाया जा सकता है.

Protocol

1. इंजेक्शन के लिए mRNA तैयारी

1. इस प्रक्रिया में इस्तेमाल किया mRNA प्लाज्मिड एन्कोडिंग (memGFP) CAAX EGFP mRNA से लिखित है. पहले Gutzman एट अल, 2008 के अनुसार प्लाज्मिड linearize.
2. फिर memGFP mMessage mMachine किट का उपयोग कर mRNA टाइप करना.
3. -80 में जिसके परिणामस्वरूप 1μg/μl mRNA, विभाज्य, और दुकान पतला डिग्री सेल्सियस
4. भ्रूण की चौड़ाई गलियों के साथ एक सेल स्तर पर 1% agarose का एक इंजेक्शन मोल्ड तैयार करें.
5. इंजेक्शन से पहले दिन में, संभोग महिलाओं से पुरुष अलग पिंजरों सेट.
6. इंजेक्शन के दिन, केशिका एक micropipette खींचने का उपयोग करने के लिए इंजेक्शन के लिए तैयार सुई खींच.

2. MRNA इंजेक्शन

1. इंजेक्शन के दिन, 1μg/μl बर्फ पर memGFP mRNA की एक विभाज्य पिघलना.
2. पानी में mRNA 01:05 200ng/μl की अंतिम एकाग्रता के लिए, पतला और बर्फ पर रख.
3. 200ng/μl पर तैयार memGFP mRNA की 1μl केशिका सुई के साथ लोड.
4. जगह एक गैस संचालित microinjector जुड़ी micromanipulator में सुई भरा हुआ है.
5. 1nl इंजेक्शन की मात्रा समायोजित करें.
6. जंगली प्रकार पिछले दिन से संभोग पिंजरों में स्थापित मछली पर डिवाइडर खींचो.
7. भ्रूण के रूप में के रूप में वे निर्धारित कर रहे हैं जल्द ही ले लीजिए. ओरिएंट उन्हें agarose इंजेक्शन मोल्ड micromanipulator से दूर पक्ष पर एकल कक्ष के साथ भ्रूण मध्यम (Westerfield 1995) के द्वारा कवर में.
8. Chorion के माध्यम से सुई और ऐसी है कि mRNA एकल कक्ष में सीधे जमा है जर्दी. प्रयोग लगभग 50 प्रतिशत भ्रूण इंजेक्षन. इंजेक्षन यदि कक्ष विभाजित किया गया है नहीं है.
9. 28 ° भ्रूण मध्यम में रातोंरात सी सेते भ्रूण

3. बढ़ते और इमेजिंग भ्रूण

1. माउंट और छवि भ्रूण करने के लिए, एक stereomicroscope एक घंटे के तहत ब्याज की समय बिंदु से पहले भ्रूण से संदंश के साथ chorion हटा दें.
2. 4 भ्रूण करने के लिए बढ़ते के लिए स्लाइड तैयार.
   • सिलिकॉन वैक्यूम तेल का प्रयोग करने के लिए एक विशेष रूप से डिजाइन 2mm मोटी एक लगभग व्यास में 1cm छेद के साथ प्लास्टिक स्लाइड के नीचे पर एक coverslip मुहर.
   • 0.7% agarose के साथ स्लाइड में छेद भरें, और के बारे में 20 मिनट या जब तक कठोर खड़े
   • एक बार agarose जम गया है, एक छोटा सा प्लग 200μl विंदुक युक्तियाँ का उपयोग करने के लिए बेलनाकार छेद के रूप में जो प्रत्येक भ्रूण माउंट हटा दें.
3. Agarose से भरे एक विदारक खुर्दबीन के नीचे स्लाइड पर भ्रूण रखें. भ्रूण anesthetize tricaine के 50μl (Westerfield 1995) जोड़ें.
4. Agarose में मस्तिष्क या अंतर्निहित coverslip के खिलाफ ब्याज के क्षेत्र के साथ बेलनाकार छेद में भ्रूण की स्थिति संदंश का प्रयोग करें.
5. एक और सिलिकॉन वैक्यूम तेल के साथ सुरक्षित coverslip के साथ agarose में भ्रूण का कवर.
6. छवि का उपयोग भ्रूण एक औंधा, फ्लोरोसेंट, लेजर स्कैनिंग या कताई डिस्क confocal खुर्दबीन. 63x या neuroepithelium भीतर एकल कक्षों के उच्च संकल्प छवियों को इकट्ठा उच्च छवि.
7. छवियाँ LSM सॉफ्टवेयर से झगड़ा फ़ाइलों के रूप में निर्यात कर रहे हैं और फ़ोटोशॉप का उपयोग का विश्लेषण किया.

4. प्रतिनिधि परिणाम / परिणाम

चित्रा 1 में दिखाया गया है midbrain और hindbrain निलय के बीच एक 24 HPF zebrafish neuroepithelium के एक प्रतिनिधि confocal छवि. प्रत्येक कोशिका झिल्ली ही सीमित GFP के साथ लेबल है.

चित्रा 1. MemGFP इंजेक्शन 24 HPF zebrafish भ्रूण के confocal इमेजिंग जीते.
(ए) GFP द्वारा उल्लिखित प्रत्येक कक्ष के साथ एक 24 HPF भ्रूण के Neuroepithelium. क्षेत्र imaged midbrain और hindbrain निलय (एम, क्रमशः एच) अलग, सीमा midbrain - hindbrain बनाने.

Discussion

इस वीडियो में, हम एकल कक्ष zebrafish भ्रूण में mRNA इंजेक्शन के लिए एक विधि का प्रदर्शन. यहाँ, हम एक झिल्ली लक्षित करने के लिए प्रत्येक कक्ष लेबल GFP mRNA एन्कोडिंग का उपयोग करें. हम तो प्रदर्शित कैसे माउंट करने के लिए और छवि एकल कक्ष संकल्प पर विकासशील मस्तिष्क. इस तकनीक हमें सेल आकार बदलने के एक उपन्यास प्रकार, बेसल कसना, सीमा midbrain - hindbrain (Gutzman एट अल, 2008) के गठन के लिए आवश्यक अध्ययन करने के लिए अनुमति दी गई है. अन्य घटना के इसी तरह के विश्लेषण के लिए काफी हड्डीवाला morphogenesis और अंतर्निहित कोशिका जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ का विस्तार करने की क्षमता है.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
SeaKem GTG agarose	Reagent	Lonza Inc.	50027
3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine)	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5040
Capillary tubing	Tool	Frederick Haer and Co.	30-30-1	Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm
Silicone vacuum grease	Reagent	VWR international	W0S717
Forceps	Tool	Fine Science Tools	11232-20	Dumont #5 Bio Inox
1-200 μl Pipette tips	Tool	USA Scientific, Inc.	111-0806	These are the correct size for 24 hpf embryos.
mMessage mMachine transcription kit	Reagent	Ambion	AM1340	SP6 RNA polymerase
Zeiss LSM 510 scanning confocal	Microscope	Carl Zeiss, Inc.
Micromanipulator	Tool	Narishige International
Microinjector	Tool	Harvard Apparatus	PLI-100
Micropipette puller	Tool	Sutter Instrument Co.