Summary
Après la formation du tube neural, le neuroépithélium resserre et se replie alors que le tube se remplit de liquide céphalorachidien embryonnaires (eCSF) pour former les ventricules du cerveau embryonnaire. Nous avons développé cette technique d'injection du ventricule afin de mieux visualiser l'espace rempli de liquide, contrairement à la forme neuroépithéliales dans un embryon vivant.
Abstract
Une bonne formation de ventricule cérébral pendant le développement embryonnaire du cerveau est nécessaire pour une fonction cérébrale normale. Ventricules cérébraux sont des cavités très conservé au sein du cerveau qui sont remplis de liquide céphalo-rachidien. Dans le poisson zèbre, après la formation du tube neural, le neuroépithélium subit une série d'étranglements et les plis tout en se remplissant de liquide entraînant la formation ventricule cérébral. Afin de comprendre le processus de formation du ventricule, et les changements de forme neuroépithéliales qui se produisent au même moment, nous avions besoin d'un moyen de visualiser l'espace ventricule en comparaison avec les tissus du cerveau. Cependant, la nature de l'embryon de poisson zèbre transparent, il est difficile de différencier le tissu de l'espace ventricule. Par conséquent, nous avons développé une technique d'injection du cerveau ventricule où l'espace le ventricule est rempli d'un colorant fluorescent et imagée par microscopie à fond clair et fluorescentes. Le clair et les images fluorescentes sont ensuite traitées et superposées dans Photoshop. Cette technique permet la visualisation de l'espace ventricule avec le colorant fluorescent, en comparaison à la forme du neuroépithélium dans l'image en fond clair. D'injection ventricule cérébral chez le poisson zèbre peut être employé à partir de 18 heures après fécondation par le biais premiers stades larvaires. Nous avons utilisé cette technique largement dans nos études de la formation et la morphogenèse ventricule cérébral ainsi que dans la caractérisation des mutants morphogenèse du cerveau (1-3).
Protocol
Protocole
Partie 1: Préparation pour la microinjection
- Préparez-vous à l'injection en tirant des aiguilles capillaire en utilisant l'aiguille extracteur Sutter Instruments.
- Remplissez l'aiguille avec un colorant fluorescent (comme le Texas-Red dextran).
- Montez l'aiguille dans un appareil de micromanipulateur et la microinjection.
- Couper l'aiguille à la taille appropriée à un angle de créer un embout biseauté.
- Mesurer la taille des gouttes et de vérifier qu'il se situe entre 1-2NL par injection dans l'huile.
Partie 2: Préparation des embryons
- Injecter les embryons 30 minutes plus tôt que le stade de l'intérêt. Par exemple, pour étudier les ventricules à 24 heures après fécondation (HPF), injecter des embryons à 23,5 HPF. Stade des embryons en fonction de Kimmel et al. (4).
- Sous la loupe binoculaire, retirez soigneusement le chorion de l'embryon en utilisant une pince.
- Utiliser un plat en plastique recouvert d'agarose à 1%, faire des trous dans l'agarose avec un plastique de 100 à 200 ul pointe de la pipette. Retirez délicatement les bouchons d'agarose par les trous en utilisant une pince.
- Transfert des embryons dans les médias d'embryon dans le plat avec des trous d'agarose.
- Ajouter tricaïne (faite selon Westerfield (5)) pour les médias à anesthésier les embryons et éviter tout mouvement pendant l'expérience.
- Placez délicatement la queue d'embryon dans le trou, et l'orienter de telle sorte que l'appareil d'injection est sur la face postérieure de l'embryon.
Partie 3: Injection du ventricule cérébral
- Pour injecter le ventricule cérébral, organiser l'installation de micromanipulation de telle sorte que l'aiguille est dans le même champ de vision que l'embryon à une puissance élevée.
- Soigneusement mis l'aiguille dans le roofplate mince du rhombencéphale juste derrière le hingepoint R0/R1 sans heurter le dessous de tissu cérébral.
- Injecter juste assez de teinture pour remplir complètement les ventricules. Cela peut prendre plusieurs injections pour combler l'espace ventricule, selon le stade de l'embryon.
Partie 4: Imagerie
- L'utilisation d'un nettoyage d'agarose 1% à revêtement plat, faire des trous de nouvelles dans le plat, retirer les bouchons, et ajouter tricaïne pour anesthésier les embryons et empêcher tout mouvement.
- Placez la queue de l'embryon ventricule injectée dans le trou et la position d'une image dorsale.
- Prenez une image en utilisant la lumière transmise.
- Il est très critique de ne pas déplacer l'embryon ou le microscope.
- Modifiez les paramètres sur le microscope et de prendre une image avec une lumière fluorescente.
- Repositionner l'embryon de prendre des images avec les deux latéraux lumière transmise et la lumière fluorescente.
- Enregistrer les images comme des fichiers TIFF pour le traitement de l'image dans Photoshop.
Partie 5: Traitement de l'image
- Pour traiter les images dans Photoshop, ouvrez la lumière transmise et la lumière fluorescente images de l'embryon mêmes prises dans la même position. Soyez sûr que tous les paramètres sont les mêmes pour chaque image.
- Faites glisser votre image fluorescente sur l'image et la lumière transmise les aligner exactement.
- Avec l'image fluorescente sélectionnée, choisissez "Image", "Réglages", puis "Remplacer couleur" et changer le fond noir au blanc.
- Dans la «couleur Remplacer« fenêtre ajuster le «flou» des facteurs à la droite jusqu'à ce que la recherche des images fluorescentes de couleur uniforme.
- Dans la palette "Calques", sélectionnez "Multiplier" permet de visualiser les images de superposition. Votre image d'espace ventricule doit correspondre à l'image de la lumière transmise exactement.
- Enregistrez ce fichier et répéter pour d'autres images.
Résultats Représentant / résultat
Une bonne image d'injection du ventricule sont présentés dans la figure 1 panneaux JC, alors un exemple d'images d'injection incorrecte sont présentés dans EH. Une bonne injections ont des bords tranchants et non diffuse colorant. D'injection incorrecte, ce qui se produit lorsque l'aiguille est insérée trop loin dans le ventricule et frappe le dessous de tissu cérébral, peut entraîner colorant qui est visible à l'extérieur de l'espace ventricule et dans le jaune.
Figure 1. Ventricule injections d'embryons HPF 25 de type sauvage. (AD) méthode d'injection correcte et (EH) méthode d'injection incorrecte sont présentés comme des exemples. (A, E) des images en fond clair avec des correspondants dorsale images fluorescentes (B, F) et la superposition des images fluorescentes et clair (C, G) pour les deux méthodes d'injection correctes et incorrectes montré. Les flèches indiquent les régions où le colorant a été au-delà de l'espace ventricule cérébral dû à une injection incorrecte du ventricule (voir «Dépannage»). Antérieure est à gauche dans toutes les images.
Dépannage:
| Problème Cause | Remède | |
| Vous êtes écraser l'embryon avec l'aiguille. | L'aiguille est trop brutale ou la pointe est trop grand. | Commencez avec une nouvelle aiguille et ne pas le casser aussi loin. Bevel votre aiguille pour le rendre pointu comme une aiguille de seringue. |
| Le colorant est tout l'embryon et le jaune (voir figure 1E-H). | Votre aiguille a travers le tissu et ne pas rester dans l'espace ventricule. | L'aiguille est peut-être pas assez tranchant, si vous êtes incapable de contrôler la vitesse de la crevaison. |
| Le colorant est trop faible ou non dans le cerveau antérieur. | Vous n'avez pas utiliser une pression suffisamment élevée pour que l'injection, ou votre aiguille n'a pas été assez loin antérieure pour atteindre le cerveau antérieur lorsque vous injecter le colorant. | Augmentez votre pression d'injection ou de placer vos aiguilles légèrement plus antérieure lors de l'injection. Vous pouvez mettre l'aiguille à travers la frontière du mésencéphale-rhombencéphale si plus de détail est nécessaire dans le prosencéphale. Vous pouvez aussi tout simplement attendre un peu pour la teinture de diffuser davantage avant d'imagerie. |
| Vos images fluorescentes sont sombres sur les bords après le remplacement de couleur dans Photoshop. | Vous avez oublié de changer le «flou» dans la fenêtre de mise en remplacement de couleur. | Déplacez le «flou» tout le chemin vers la droite dans la fenêtre de remplacement de couleur. |
| L'aiguille va pas percer la roofplate rhombencéphale. | Votre aiguille n'est pas coupé correctement. | Faire une nouvelle aiguille. Si vous faites beaucoup d'injections, vous devrez peut-être plusieurs aiguilles qu'ils peuvent obtenir terne. |
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Discussion
Dans cette vidéo, nous démontrons comment injecter un colorant fluorescent (Texas Red dextran) dans le développement des ventricules cérébraux poisson zèbre. Cette méthode est utilisée pour visualiser l'espace ventricule cérébral en contraste avec le neuroépithélium environnantes et est extrêmement utile pour déterminer la forme de l'espace du ventricule, ainsi que la forme du tissu cérébral environnant. Il nous permet de mieux comprendre le processus de formation du ventricule du cerveau et du cerveau au cours du temps la morphogenèse de l'embryon vivant. Cette technique est un excellent outil pour étudier les défauts du cerveau ventricule formation et pour la caractérisation initiale et l'étude de mutants morphogenèse du cerveau.
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Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Laura Anne Lowery qui a développé cette technique dans le laboratoire. SH est soutenue par NIHMH70926. Jennifer Gutzman a été soutenue par la bourse CSBI / Merck postdoctoraux.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Capillary Tubes (needles) | Tools | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | |
| Agarose-Coated dishes | Tools | Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning) | Agarose (50027) Dishes (430166) | Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting |
| Dissecting Microscope | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software | Tools | |||
| 1-200 μ pipette tips | Tools | USA Scientific, Inc. | 1111-0806 | These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly. |
| Photoshop | Image Analysis | Adobe | ||
| Embryo Loop | Tools | Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax. | ||
| Microinjector | Tools | Harvard Apparatus | PL1-100 | |
| Needle Puller | Tools | Sutter Instrument Co. | Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70). | |
| Micromanipulator | Tools | Narishige International | ||
| Fluorescent dye Texas-Red Dextran 70,000MW | Reagent | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | Other Molecular weights are available if desired. |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester) | Reagent | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Embryo Media | Reagent | According to Westerfield (5) |
References
- Gutzman, J. H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).
- Lowery, L. A. Characterization and Classification of Zebrafish Brain Morphology Mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Kimmel, C. B.
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish. , University of Oregon Press. (1995).
