Summary
Nöral tüp oluşumu sonra neuroepithelium daraltır ve tüp embriyonik beyin ventriküller oluşturmak için embriyonik beyin omurilik sıvısı (eCSF) ile doldurur katlanabilir. Biz daha iyi, canlı embriyo nöroepitelyal şekli aksine sıvı dolu boşluk görselleştirmek için bu ventrikül enjeksiyon tekniği geliştirdi.
Abstract
Uygun embriyonik beyin gelişimi sırasında beyin ventrikül oluşumu normal beyin fonksiyonu için gereklidir. Beyin ventriküller, beyin omurilik sıvısı ile dolu, beynin içinde son derece korunmuş boşluklar vardır. Zebra balığı olarak, nöral tüp oluşumu sonrası, beyin ventrikül oluşumu ile sonuçlanan bir sıvı ile doldurur neuroepithelium daralması ve kıvrımlarının bir dizi uğrar. Ventrikül oluşum süreci, aynı zamanda meydana gelen nöroepitelyal şekil değişiklikleri anlamak için, beyin dokusu ile karşılaştırıldığında ventrikül alanı görselleştirmek için bir yol gerekiyordu. Ancak, şeffaf zebrafish embriyoların doğası zor ventrikül uzaydan gelen doku ayırt etmek için yapar. Bu nedenle, ventrikül alan floresan boya ile doldurulmuş ve aydınlık ve floresan mikroskobu ile görüntülü bir beyin ventrikül enjeksiyon tekniği geliştirdi. Aydınlık ve floresan görüntüler daha sonra işlenmiş ve Photoshop bindirilmiş. Bu teknik, aydınlık görüntü neuroepithelium şekline göre, floresan boya ile ventrikül alanı görünüm için sağlar. Zebrafish Beyin ventrikül enjeksiyon erken larva aşamalardan 18 saat sonra döllenme ile istihdam edilebilirler. Biz yanı sıra beyin morfolojilerinden mutantlar (1-3) karakterize beyin ventrikül oluşumu ve morfolojilerinden çalışmalarımız yoğun bu tekniği kullanmıştır.
Protocol
Protokol
Bölüm 1: mikroenjeksiyon için hazırlık
- Sutter Aletleri iğne çektirmenin kullanarak kılcal iğneler çekerek enjeksiyon için hazırlayın.
- (Teksas Kırmızı Dextran'ın gibi) floresan boya ile iğne doldurun.
- Iğne mikromanipülatör ve mikroenjeksiyon cihazları monte edin.
- Eğimli bir ipucu oluşturmak için uygun büyüklükte iğne bir açıyla kesin.
- Damla boyutu ölçün ve petrol enjeksiyon başına 1-2nl arasında olduğunu kontrol edin.
Bölüm 2: embriyoların hazırlanması
- Embriyoların ilgi aşamasında daha 30 dakika önce enjekte edilir. Örneğin, 24 saat sonra döllenme (hpf) ventriküllerin çalışma, 23.5 hpf embriyolar enjekte edilir. Sahne Kimmel ve ark göre, embriyolar. (4).
- Stereomikroskop altında, forseps kullanarak embriyoların dikkatle koryon çıkarın.
- % 1 agaroz ile kaplı plastik tabak, plastik 1-200 ul pipet ucu ile agaroz delik karıştırmak. Forseps kullanarak deliklerden agaroz fişler dikkatlice çıkarın.
- Agaroz delikli çanak içine embriyolar embriyo medya aktarın.
- Medya ekle tricaine Westerfield (5) göre yapılan embriyoların uyutmak ve deneme sırasında hareket etmesini önlemek için.
- Deliğin içine embriyo kuyruk hafifçe aşağı gelecek şekilde yerleştirin ve böylece enjeksiyon cihazı embriyonun arka tarafında yönlendirmek bu.
Bölüm 3: beyin ventrikül enjekte
- Beyin ventrikül enjekte etmek, iğne ucu, aynı alanda yüksek güç embriyo olarak böylece mikromanipülasyon kurulum düzenliyoruz.
- Dikkatlice aşağıdaki beyin dokusu vurmadan r0/r1 hingepoint sadece arka Beyin ince roofplate iğne koymak.
- Enjekte ventriküller tamamen doldurmak için yeterli boya. Embriyo aşamasına bağlı olarak, ventrikül boşluğu doldurmak için çeşitli enjeksiyonlar sürebilir.
Bölüm 4: Görüntüleme
- Kullanarak, temiz bir% 1 agaroz kaplı çanak çanak yeni delikler karıştırmak, fişlerin kaldırmak ve embriyoların uyutmak ve hareket etmesini önlemek için tricaine ekleyin.
- Ventrikül enjekte embriyo kuyruk, dorsal bir görüntü için delik ve konuma yerleştirin.
- Iletilen ışık kullanarak bir resim çekin.
- EMBRİYO VEYA MİKROSKOBU HAREKET çok kritik.
- Mikroskop ayarları değiştirin ve floresan ışığı ile bir görüntü almak.
- Iletilen ışık ve floresan ışığı ile yanal görüntüleri çekmek için embriyo konumlandırın.
- Photoshop görüntü işleme için TIFF dosyaları olarak kaydedin.
Bölüm 5: Görüntü İşleme
- Photoshop görüntüleri işlemek için, iletilen ışık ve floresan ışığı görüntüleri, aynı pozisyonda alınan aynı embriyo açın. Tüm ayarları her bir resim için aynı olduğundan emin olun.
- Floresan görüntü iletilen ışık görüntü üzerine sürükleyin ve onları tam olarak hizaya.
- Floresan görüntü seçildiğinde, "Resim", "Ayarlamalar, seçme" ve ardından "rengini değiştirme" ve beyaz siyah arka plan değiştirmek.
- Floresan görüntüler tekdüze renkli görünüyor kadar sağ "rengini değiştirin" penceresinde "bulanıklık" faktörü ayarlamak.
- "Katmanlar" penceresinde, bindirme görüntüleri izlemek için "Multiply" seçeneğini seçin. Ventrikül alan görüntü tam olarak iletilen ışık görüntü uyumlu olmalıdır.
- Bu dosya ve herhangi bir diğer görüntüler için tekrar kaydedin.
Temsilcisi Sonuçlar / Sonuç
Yanlış enjeksiyon görüntülerin bir örnek EH içinde gösterilmiştir Uygun ventrikül enjeksiyon görüntüleri, 1 panelleri AD Şekil gösterilmektedir. Uygun enjeksiyonları, keskin kenarları olmayan diffüz boya var. Iğne çok uzak ventrikül içine yerleştirilir ve beyin dokusu vurur altında olduğunda oluşur yanlış enjeksiyon, ventrikül alanı dışında görünür boya ve yumurta sarısında neden olabilir.
Şekil 1. 25 hpf vahşi tip embriyoların ventrikül enjeksiyonları Doğru enjeksiyon yöntemi (AD) ve (EH) yanlış enjeksiyon yöntemi örnek olarak gösterilmiştir. (A, E) Dorsal aydınlık görüntüleri (B, F) ve floresan ve aydınlık görüntülerin gösterildiği hem doğru ve yanlış enjeksiyon yöntemleri için kaplama (C, G) ilgili floresan görüntüler. Oklar, yanlış bir ventrikül enjeksiyon ("Sorun Giderme" bölümüne bakın) nedeniyle beyin ventrikül mekanın ötesinde boya gitti bölgelerde gösterir. Anterior tüm resimlerin sol.
Sorun Giderme:
| Sorun Neden | Çare | |
| Iğne ile embriyo Ezici. | Iğne çok künt veya ucu çok büyük. | Yeni bir iğne ile başlayın ve bu kadar geri bozmazlar. Konik sizin iğne gibi keskin bir şırınga iğnesi yapmak. |
| Boya (bkz. Şekil 1E-H), embriyo ve yumurta sarısı boyunca. | İğne doku geçti ve ventrikül boşluk kalmadı. | Iğne yeteri kadar keskin olmayabilir, ponksiyon hızını kontrol etmek mümkün değildir. |
| Boya önbeyin çok zayıf ya da değildir. | Enjeksiyon için yeterince yüksek bir basınç kullanmayın, ya da iğne kadar boya enjekte edildiğinde önbeyin ulaşmak için yeterli ön değildi. | Enjeksiyon basıncı artırın ya da enjeksiyon sırasında iğne biraz daha ön yerleştirin. Daha ayrıntılı önbeyin gerekli ise orta beyin arka beyin sınır boyunca iğne koyabilirsiniz. Ayrıca, sadece ileri görüntüleme önce diffüz boya için biraz bekleyebilir. |
| Fluoresan görüntüler Photoshop renk değişiminden sonra kenarlarında koyu. | Renk değiştirme penceresinde "bulanıklık" ayarını değiştirmek için unuttum. | "Bulanık" renk değiştirme penceresi doğru şekilde hareket ettirin. |
| Iğne Beyin roofplate değil. | Iğne düzgün kesilmiş değildir. | Yeni bir iğne olun. Enjeksiyon yapıyoruz, mat gibi çeşitli iğneler gerekebilir. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu video floresan boya (Texas-Kırmızı Dextran) Zebra balığı beyin ventriküller gelişmekte içine enjekte etmek için nasıl gösterilmektedir. Bu yöntem beynin ventrikül alanı çevreleyen neuroepithelium aksine görselleştirmek için kullanılan ve ventrikül alanı şekline yanı sıra çevredeki beyin dokusu şeklini belirlemek için son derece yararlı. Bu zaman içinde canlı embriyo beyin ventrikül oluşumu ve beyin morfolojilerinden süreci daha iyi anlamak için bize izin verir. Bu teknik, beyin ventrikül oluşumu kusurları okuyan ve ilk karakterizasyonu ve beyin morfolojilerinden mutantlar çalışma için mükemmel bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar, laboratuvar bu tekniği geliştirdi Laura Anne Lowery teşekkür etmek istiyorum. HS NIHMH70926 tarafından desteklenmektedir. Jennifer Gutzman CSBi / Merck, doktora sonrası burs tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Capillary Tubes (needles) | Tools | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | |
| Agarose-Coated dishes | Tools | Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning) | Agarose (50027) Dishes (430166) | Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting |
| Dissecting Microscope | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software | Tools | |||
| 1-200 μ pipette tips | Tools | USA Scientific, Inc. | 1111-0806 | These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly. |
| Photoshop | Image Analysis | Adobe | ||
| Embryo Loop | Tools | Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax. | ||
| Microinjector | Tools | Harvard Apparatus | PL1-100 | |
| Needle Puller | Tools | Sutter Instrument Co. | Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70). | |
| Micromanipulator | Tools | Narishige International | ||
| Fluorescent dye Texas-Red Dextran 70,000MW | Reagent | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | Other Molecular weights are available if desired. |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester) | Reagent | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Embryo Media | Reagent | According to Westerfield (5) |
References
- Gutzman, J. H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).
- Lowery, L. A. Characterization and Classification of Zebrafish Brain Morphology Mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Kimmel, C. B.
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish. , University of Oregon Press. (1995).
