Zebrafish의 두뇌 뇌실 주입

Summary

신경 튜브 형성 후, neuroepithelium은 수축과 튜브가 배아 두뇌 심실을 형성하기 위해 배아 뇌척수 (eCSF)로 채우고 동안 주름. 우리는 더 나은 라이브 배아에서 neuroepithelial 모양 대조적으로 액체 채워진 공간을 시각화이 뇌실 주입 기술을 개발했습니다.

Abstract

배아 두뇌 개발하는 동안 적절한 두뇌 뇌실 형성은 정상적인 뇌 기능이 필요합니다. 뇌 심실은 뇌척수로 가득하는 두뇌 내의 고도 보존 충치 있습니다. 그것이 두뇌 뇌실 형성의 결과로 액체로 채우고있는 동안 zebrafish에서 신경 튜브 형성 후, neuroepithelium는 constrictions과 주름 일련의를 겪습. 뇌실 형성 과정과 동시에 발생하는 neuroepithelial 모양의 변화를 이해하기 위해서, 우리는 뇌 조직에 비해 뇌실 공간을 시각화하는 방법이 필요했습니다. 그러나, 투명한 zebrafish의 배아의 본질은 어려운 뇌실 우주에서 조직을 차별화 수 있습니다. 따라서, 우리는 뇌실 공간이 형광 염료 가득한과 브라이트 및 형광 현미경으로 몇 군데있는 두뇌 뇌실 사출 기술을 개발했습니다. 브라이트과 형광 이미지는 다음 처리와 포토샵으로 겹쳐있다. 이 기법은 브라이트 이미지의 neuroepithelium의 형태 비교, 형광 염료와 뇌실 공간의 시각화를위한 수 있습니다. zebrafish의 뇌 뇌실 주입은 초기 애벌레 단계를 통해 18시간 게시물 수정에서 근무하실 수 있습니다. 우리는뿐만 아니라 두뇌 morphogenesis의 돌연변이 (1-3)를 특성화 같이 뇌실 뇌 형성과 morphogenesis 우리의 연구에 광범위하게이 기술을 사용했습니다.

Protocol

프로토콜

1 부 : microinjection에 대비하여

1. 서터 인스 트루먼 트의 바늘 풀러를 사용하여 모세 바늘을 떼어하여 사출을위한 준비.
2. 형광 염료 (예 : 텍사스 - 레드 Dextran 등)로 바늘을 입력합니다.
3. micromanipulator과 microinjection 장치에 바늘을 탑재합니다.
4. beveled 팁을 만들 수있는 각도로 적절한 크기로 바늘을 잘라요.
5. 드롭 크기를 측정하고 기름 주입 당 1 2nl 사이에 있는지 확인합니다.

2 부 : 배아 준비

1. 관심의 무대 30 분만 일찍 배아를 주사. 예를 들어, 24 시간 게시물 수정 (HPF)에서 심실을 공부하기 위해, 23.5 HPF에서 배아를 주입. 킴멀 외에 따라 배아를 무대. (4).
2. stereomicroscope에서 신중하게 집게를 사용하여 태아의 chorion를 제거합니다.
3. 1% 아가로 오스와 코팅 플라스틱 접시를 사용하여 플라스틱 1-200 μl 피펫 팁있는 아가로 오스의 구멍을 찌르지. 조심스럽게 집게를 사용하여 구멍의 아가로 오스의 플러그를 제거합니다.
4. 구멍 아가로 오스 요리에 배아 미디어의 배아를 전송합니다.
5. 미디어에 추가 tricaine은 (웨스 터 필드 (5)에 따라 만들어진)은 배아를 마취 및 실험 도중 움직임을 방지하기 위해.
6. 부드럽게 구멍에 배아 꼬리를 장소, 사출 장치는 배아의 후부 측면에 있도록 동양 그것.

파트 3 : 뇌의 뇌실을 주입

1. 뇌의 뇌실을 삽입하려면 바늘 끝이 높은 전원 배아로보기 같은 분야에서되도록 미세 조작 설정을 주선해드립니다.
2. 조심스럽게 아래의 뇌 조직을 누르지 말고 r0/r1 hingepoint 단 후부 hindbrain의 얇은 roofplate를 통해 바늘을 넣어.
3. 주입은 충분히 완전히 심실을 채우기 위해 염료. 그것은 배아의 단계에 따라 뇌실 공간을 채우기 위해 여러 가지 주사 걸릴 수 있습니다.

4 부 : 영상

1. 깨끗한 1퍼센트 아가로 오스 - 코팅 접시를 사용하여 요리에 새로운 구멍을 찌르지, 플러그를 제거하고 배아를 마취하고 움직임을 방지하기 위해 tricaine를 추가합니다.
2. 지느러미 이미지의 구멍과 위치에 뇌실 - 주입된 배아의 꼬리를 놓습니다.
3. 전송 빛을 사용하여 이미지를 가져가라.
4. 그것은 배아 또는 현미경을 이동할하는 것은 매우 중요합니다.
5. 현미경의 설정을 변경하고 형광등과 이미지를 가져가라.
6. 전송 빛 형광 불빛 모두 측면 이미지를 취할 배아를 재조 정할.
7. 포토샵에서 이미지 처리를 위해 TIFF 파일로 이미지를 저장합니다.

제 5 부 : 이미지 처리

1. 포토샵에서 이미지를 처리​​하기 위해, 전송 조명과 같은 위치에서 찍은 같은 배아의 형광 이미지를 엽니다. 모든 설정은 각 이미지의 동일해야합니다.
2. 전송 빛의 이미지에 귀하의 형광 이미지를 드래그하고이를 정확하게 라인.
3. 형광 이미지가 선택된 상태에서 "이미지", "조정 선택"다음 "색상 바꾸기"과 흰색에 검정색 배경을 변경할 수 있습니다.
4. 형광 이미지 색상의 균일 보인다 때까지 "바꾸기 컬러"창에서 오른쪽에있는 "fuzziness"요소를 조정합니다.
5. '레이어'창에서 오버레이 이미지를 볼 수 있습니다 "곱하기"을 선택합니다. 당신의 뇌실 공간 이미지가 정확하게 전송 빛의 이미지와 일치해야합니다.
6. 다른 이미지에 대해이 파일과 반복을 저장합니다.

대표 결과 / 결과

잘못된 사출 이미지의 예제 EH 표시하는 동안 적절한 뇌실 주입 이미지는 1 패널 AD 그림에 표시됩니다. 적절한 주사는 날카로운 가장자리와 비 확산 염료 있습니다. 바늘이 꽂혔어 너무 멀리 삽입 아래의 뇌 조직을 치는 경우에 발생합니다 잘못된 주사, 뇌실 공간의 볼 수 밖에 염료와 노른자가 발생할 수 있습니다.

그림 1. 25 HPF 야생 유형 태아의 뇌실 주사. (AD) 올바른 주사 방법과 (EH) 잘못된 주입 방법은 예제로 표시됩니다. 해당 형광 이미지 (A, E) 도설 브라이트 이미지 (B, F)와 같이 정확하고 잘못된 모두 주입 방법에 대한 형광 및 브라이트 이미지의 오버레이 (C, G). 화살표는 염색이 잘못된 뇌실 주입 ( "문제 해결"을 참조)로 인해 뇌의 뇌실 공간 넘어 간 영역을 나타냅니다. 앞의 모든 이미지 왼쪽입니다.

문제 해결 :

문제 원인	치료제
당신은 바늘로 배아를 부수 있습니다.	당신의 바늘이 너무 무딘거나 끝이 너무 큽니다.	새 바늘로 시작하여 그것을 멀리 다시 휴식하지 않습니다. 베벨은 바늘 주사기 바늘처럼 날카로운 만들 수 있습니다.
염료 (그림 1E - H 참조) 배아와 노른자에 걸쳐있다.	당신의 바늘은 조직을 통해 가서 뇌실 공간에서 체류하지 않았다.	당신의 바늘을 충분히 예리하지 않을 수 있습니다 당신이 주사의 속도를 제어 수 없습니다 그래서.
염료는 forebrain 너무 희미하거나하지 않습니다.	당신은 주사만큼 충분히 높은 압력을 사용하지 않았거나 바늘은 멀리 당신이 염료를 주입 때 forebrain에 도달하는 앞쪽에되지 않았습니다.	귀하의 분사 압력을 높이거나 사출 동안 바늘이 약간 더 앞쪽에 놓습니다. 자세한 내용은 forebrain에 필요한 경우에는 midbrain - hindbrain 경계를 통해 바늘을 넣을 수 있습니다. 당신은 또한 단순히 영상 전에 더욱 확산하는 염료에 대해 조금만 기다려 수 있습니다.
당신의 형광 이미지를 포토샵에서 색상 교체 후 가장자리 주위에 어두운 있습니다.	당신은 색상 바꾸기 창에서 "fuzziness"설정을 변경하려면 잊어버렸습니다.	"fuzziness"그 색상 바꾸기 창에서 오른쪽에있는 모든 방법을 이동합니다.
바늘이 찔린 hindbrain의 roofplate하지 않습니다.	당신의 주사 바늘을 제대로 절단되지 않습니다.	새로운 바늘을합니다. 당신이 주사를 많이하고있다면 그들이 무딘 얻을 수있는 몇 가지 바늘이 필요할 수 있습니다.

Discussion

이 비디오에서 우리는 zebrafish 두뇌 ​​심실 개발에 형광 염료 (텍사스 - 레드 Dextran)를 주입하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 주변 neuroepithelium 달리 뇌 뇌실 공간을 시각화하는 데 사용과 뇌실 공간의 형태뿐 아니라 주변의 뇌 조직의 모양을 결정하는 매우 유용합니다. 우리가 더 나은 살아있는 배아에서 시간이 지남에 따라 뇌 뇌실 형성 및 뇌 morphogenesis의 과정을 이해할 수 있습니다. 이 기술은 뇌의 뇌실 형성 결함을 공부 및 초기 특성화 및 뇌 morphogenesis의 돌연변이 연구를위한 훌륭한 도구입니다.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	Tool	Fine Science Tools	11252-20
Capillary Tubes (needles)	Tools	Frederick Haer and Co.	30-30-1
Agarose-Coated dishes	Tools	Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning)	Agarose (50027) Dishes (430166)	Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting
Dissecting Microscope	Microscope	Carl Zeiss, Inc.
Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software	Tools
1-200 μ pipette tips	Tools	USA Scientific, Inc.	1111-0806	These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly.
Photoshop	Image Analysis	Adobe
Embryo Loop	Tools			Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax.
Microinjector	Tools	Harvard Apparatus	PL1-100
Needle Puller	Tools	Sutter Instrument Co.		Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70).
Micromanipulator	Tools	Narishige International
Fluorescent dye Texas-Red Dextran 70,000MW	Reagent	Molecular Probes, Life Technologies	D1830	Other Molecular weights are available if desired.
Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester)	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5040
Embryo Media	Reagent			According to Westerfield (5)