Summary
न्यूरल ट्यूब गठन के बाद, neuroepithelium constricts और परतों जबकि ट्यूब भ्रूण मस्तिष्कमेरु द्रव (eCSF) भ्रूण मस्तिष्क ventricles के फार्म के साथ भरता है. हम इस निलय इंजेक्शन तकनीक विकसित करने के लिए बेहतर से एक जीवित भ्रूण में neuroepithelial आकार के विपरीत में तरल पदार्थ भरा अंतरिक्ष कल्पना.
Abstract
भ्रूण के मस्तिष्क के विकास के दौरान उचित मस्तिष्क वेंट्रिकल गठन सामान्य मस्तिष्क समारोह के लिए आवश्यक है. मस्तिष्क ventricles के दिमाग है कि मस्तिष्कमेरु द्रव के साथ भर रहे हैं के भीतर cavities उच्च संरक्षित कर रहे हैं. Zebrafish में, न्यूरल ट्यूब गठन के बाद, neuroepithelium संकोचनों और परतों की एक श्रृंखला आए जबकि यह मस्तिष्क वेंट्रिकल गठन में जिसके परिणामस्वरूप तरल पदार्थ के साथ भरता है. आदेश में समझने के लिए निलय गठन की प्रक्रिया, और neuroepithelial आकार में परिवर्तन है कि एक ही समय में होते हैं, हम मस्तिष्क के ऊतकों की तुलना में निलय अंतरिक्ष कल्पना की जरूरत है. हालांकि, पारदर्शी zebrafish भ्रूण की प्रकृति यह निलय अंतरिक्ष से मुश्किल ऊतक अंतर करने के लिए बनाता है. इसलिए, हम एक मस्तिष्क निलय इंजेक्शन तकनीक जहां वेंट्रिकल अंतरिक्ष एक फ्लोरोसेंट रंजक के साथ भरा हुआ है और brightfield और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged विकसित की है. brightfield और फ्लोरोसेंट छवियों तब संसाधित कर रहे हैं और फ़ोटोशॉप में आरोपित हैं. इस तकनीक brightfield छवि में neuroepithelium के आकार की तुलना में, फ्लोरोसेंट रंजक के साथ निलय अंतरिक्ष के दृश्य के लिए अनुमति देता है. Zebrafish में ब्रेन निलय इंजेक्शन जल्दी लार्वा चरणों के माध्यम से 18 घंटे के बाद निषेचन से नियोजित किया जा सकता है. हम इस तकनीक का इस्तेमाल किया है बड़े पैमाने पर अच्छी तरह के रूप में मस्तिष्क morphogenesis म्यूटेंट (1-3) निस्र्पक में मस्तिष्क के वेंट्रिकल गठन और morphogenesis के हमारे अध्ययन में.
Protocol
प्रोटोकॉल
भाग 1: microinjection के लिए तैयारी
- केशिका Sutter उपकरण सुई खींचने का उपयोग सुइयों खींच द्वारा इंजेक्शन के लिए तैयार है.
- एक फ्लोरोसेंट रंजक (जैसे टेक्सास रेड Dextran) के साथ सुई भरें.
- एक micromanipulator और microinjection तंत्र में सुई माउंट.
- एक कोण पर एक beveled टिप बनाने के लिए उपयुक्त आकार के सुई कट.
- ड्रॉप आकार को मापने और जाँच करें कि यह तेल में इंजेक्शन के प्रति एक - 2nl के बीच है.
भाग 2: भ्रूण की तैयारी
- 30 मिनट के हित के मंच से पहले भ्रूण इंजेक्षन. उदाहरण के लिए, 24 घंटे के पोस्ट निषेचन (HPF) निलय अध्ययन करने के लिए, 23.5 HPF पर भ्रूण इंजेक्षन. Kimmel एट अल के अनुसार भ्रूण स्टेज. (4).
- Stereomicroscope के तहत, ध्यान संदंश का उपयोग भ्रूण से chorion हटा दें.
- 1% agarose के साथ एक प्लास्टिक लेपित पकवान का प्रयोग, एक प्लास्टिक 1-200 μl विंदुक टिप के साथ agarose में छेद प्रहार. ध्यान agarose प्लग संदंश का उपयोग कर छेद से हटा दें.
- Agarose डिश में छेद के साथ भ्रूण मीडिया में भ्रूण का स्थानांतरण.
- जोड़ें मीडिया को tricaine भ्रूण (Westerfield (5) के अनुसार) बनाया anesthetize करने के लिए और प्रयोग के दौरान आंदोलन को रोकने.
- धीरे भ्रूण पूंछ जगह छेद में नीचे, और यह उन्मुख ताकि इंजेक्शन तंत्र भ्रूण के पीछे की ओर पर है.
भाग 3: मस्तिष्क निलय इंजेक्शन
- मस्तिष्क के वेंट्रिकल इंजेक्षन, micromanipulation सेटअप इतना है कि सुई टिप उच्च शक्ति पर भ्रूण के रूप में देखने के एक ही क्षेत्र में है की व्यवस्था.
- ध्यान से hindbrain बस r0/r1 hingepoint पीछे की पतली roofplate के माध्यम से मस्तिष्क के ऊतकों के नीचे मारने के बिना सुई डाल दिया.
- सुई बस पर्याप्त के लिए पूरी तरह से निलय भरने डाई. यह कई इंजेक्शन लेने के लिए निलय स्थान को भरने सकता है भ्रूण की अवस्था पर निर्भर करता है.
भाग 4: इमेजिंग
- एक साफ 1% agarose लेपित पकवान का प्रयोग, पकवान में नए छेद प्रहार, प्लग को हटाने, और tricaine जोड़ने के लिए भ्रूण anesthetize और आंदोलन को रोकने.
- निलय इंजेक्शन भ्रूण की पूंछ और एक पृष्ठीय छवि के लिए छेद स्थिति में रखें.
- एक संचारित प्रकाश का उपयोग कर छवि ले लो.
- यह बहुत महत्वपूर्ण है के लिए भ्रूण या खुर्दबीन कदम नहीं है.
- खुर्दबीन पर सेटिंग्स बदलें और फ्लोरोसेंट रोशनी के साथ एक छवि ले.
- Reposition भ्रूण दोनों संचारित और प्रकाश फ्लोरोसेंट रोशनी के साथ पार्श्व चित्र लेने.
- फ़ोटोशॉप में छवि प्रसंस्करण के लिए झगड़ा फ़ाइलों के रूप में छवियों को बचाओ.
भाग 5: छवि प्रसंस्करण
- Photoshop में छवियों की प्रक्रिया करने के लिए, संचारित प्रकाश और एक ही एक ही स्थिति में लिया भ्रूण के फ्लोरोसेंट प्रकाश छवियों को खोलने के. सुनिश्चित करें कि सभी सेटिंग्स के प्रत्येक छवि के लिए वही कर रहे हैं.
- प्रेषित प्रकाश छवि पर अपने फ्लोरोसेंट छवि को खींचें और वास्तव में उन्हें लाइन.
- फ्लोरोसेंट छवि चयनित के साथ, "छवि," "समायोजन, का चयन करें" और फिर "रंग बदलें" और सफेद करने के लिए काले रंग की पृष्ठभूमि परिवर्तन.
- "रंग बदलें" विंडो में सही करने के लिए "fuzziness" कारक समायोजित जब तक फ्लोरोसेंट छवियों के रंग में एक समान लग रहा है.
- "परत" विंडो में चयन करें, "गुणा" उपरिशायी छवियों को देखने. आपका निलय अंतरिक्ष छवि प्रेषित प्रकाश छवि बिल्कुल मैच चाहिए.
- किसी भी अन्य छवियों के लिए इस फ़ाइल और दोहराने सहेजें.
प्रतिनिधि परिणाम / परिणाम
उचित निलय इंजेक्शन छवियों को एक पैनल ई. चित्रा में दिखाया जाता है, जबकि गलत इंजेक्शन छवियों का एक उदाहरण एह में दिखाए जाते हैं. उचित इंजेक्शन तेज किनारों और गैर फैलाना डाई है. गलत इंजेक्शन, जो तब होता है जब सुई भी दूर वेंट्रिकल में डाला है और मस्तिष्क के ऊतकों के नीचे हिट डाई है कि निलय अंतरिक्ष के बाहर दिखाई है और जर्दी में परिणाम कर सकते हैं.
चित्रा 1. निलय इंजेक्शन (ई.) के 25 HPF जंगली प्रकार भ्रूण का सही इंजेक्शन विधि (एह) गलत इंजेक्शन विधि उदाहरण के रूप में दिखाए जाते हैं . (ए, ई) इसी फ्लोरोसेंट छवियों के साथ पृष्ठीय brightfield छवियाँ (बी, एफ) और फ्लोरोसेंट और brightfield छवियों के दोनों सही और गलत इंजेक्शन दिखाया तरीकों के लिए (सी, जी) उपरिशायी. तीर क्षेत्रों जहां डाई मस्तिष्क वेंट्रिकल एक गलत निलय इंजेक्शन ("समस्या निवारण" देखें) की वजह से अंतरिक्ष से परे चला गया है संकेत मिलता है. पूर्वकाल सभी छवियों में बाईं ओर है.
समस्या निवारण:
| समस्या कारण | उपाय | |
| तुम सुई के साथ भ्रूण squashing हैं. | आपका सुई भी कुंद है या टिप बहुत बड़ी है. | एक नई सुई के साथ शुरू करते हैं तोड़ने के रूप में वापस दूर नहीं है. बेवेल अपने एक सिरिंज सुई की तरह यह तेजी से बनाने सुई. |
| डाई भ्रूण और जर्दी भर है (1E-एच चित्र देखें). | आपका सुई ऊतक के माध्यम से चला गया और निलय अंतरिक्ष में रहने नहीं है. | आपका सुई तेज पर्याप्त नहीं किया जा सकता है, तो आप पंचर की गति को नियंत्रित करने में असमर्थ हैं. |
| डाई भी बेहोश है या अग्रमस्तिष्क में नहीं है. | तुम इंजेक्शन के लिए एक उच्च पर्याप्त दबाव नहीं उपयोग करते हैं, किया है या अपने सुई अभी तक पर्याप्त अग्रमस्तिष्क तक पहुँचने के लिए जब आप डाई इंजेक्शन पूर्वकाल नहीं था. | अपने इंजेक्शन दबाव बढ़ाने के लिए या अपने सुई से थोड़ा अधिक इंजेक्शन के दौरान पूर्वकाल जगह. आप सीमा midbrain - hindbrain के माध्यम से सुई डाल अगर अग्रमस्तिष्क में और अधिक विस्तार की आवश्यकता है सकते हैं. तुम भी बस आगे फैलाना रंग के लिए एक बिट कर सकते हैं इमेजिंग से पहले इंतजार. |
| आपका फ्लोरोसेंट छवियों Photoshop में रंग बदलने के बाद किनारों के आसपास अंधेरे हैं. | तुम रंग को प्रतिस्थापित विंडो में "fuzziness" सेटिंग को बदलने के लिए भूल गया. | "Fuzziness" रंग को प्रतिस्थापित विंडो में सही करने के लिए सभी रास्ते ले जाएँ. |
| सुई hindbrain roofplate पंचर नहीं होगा. | आपका सुई ठीक से नहीं काट रहा है. | एक नई सुई बनाओ. यदि आप इंजेक्शनों की एक बहुत कुछ कर रहे हैं आप कई सुइयों की आवश्यकता है के रूप में वे सुस्त प्राप्त कर सकते हैं हो सकता है. |
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Discussion
हम इस वीडियो में प्रदर्शन कैसे zebrafish मस्तिष्क ventricles के विकास में फ्लोरोसेंट रंजक (टेक्सास लाल Dextran) इंजेक्षन करने के लिए. इस विधि के आसपास neuroepithelium के विपरीत में मस्तिष्क के वेंट्रिकल अंतरिक्ष कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है और निलय अंतरिक्ष के आकार के रूप में अच्छी तरह से आसपास के मस्तिष्क के ऊतकों के आकार का निर्धारण करने के लिए अत्यंत उपयोगी है. यह हमें बेहतर मस्तिष्क वेंट्रिकल गठन और जीवित भ्रूण में मस्तिष्क morphogenesis समय पर की प्रक्रिया को समझने के लिए अनुमति देता है. इस तकनीक में मस्तिष्क के वेंट्रिकल गठन दोष के अध्ययन के लिए और प्रारंभिक लक्षण वर्णन और मस्तिष्क morphogenesis म्यूटेंट के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है.
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Acknowledgments
लेखकों के लिए लौरा ऐनी Lowery जो प्रयोगशाला में इस तकनीक विकसित धन्यवाद देना चाहूंगा. एच एस NIHMH70926 द्वारा समर्थित है. जेनिफर Gutzman / CSBi मर्क postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Capillary Tubes (needles) | Tools | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | |
| Agarose-Coated dishes | Tools | Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning) | Agarose (50027) Dishes (430166) | Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting |
| Dissecting Microscope | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software | Tools | |||
| 1-200 μ pipette tips | Tools | USA Scientific, Inc. | 1111-0806 | These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly. |
| Photoshop | Image Analysis | Adobe | ||
| Embryo Loop | Tools | Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax. | ||
| Microinjector | Tools | Harvard Apparatus | PL1-100 | |
| Needle Puller | Tools | Sutter Instrument Co. | Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70). | |
| Micromanipulator | Tools | Narishige International | ||
| Fluorescent dye Texas-Red Dextran 70,000MW | Reagent | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | Other Molecular weights are available if desired. |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester) | Reagent | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Embryo Media | Reagent | According to Westerfield (5) |
References
- Gutzman, J. H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).
- Lowery, L. A. Characterization and Classification of Zebrafish Brain Morphology Mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Kimmel, C. B.
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish. , University of Oregon Press. (1995).
