ゼブラフィッシュの脳室注入

Summary

神経管形成後に、神経上皮は収縮し、真空管が胚の脳室を形成するために胚性脳脊髄液（eCSF）でいっぱいにしながら折る。我々は、よりよい生きている胎児の神経上皮の形状とは対照的に、流体の満たされた空間を視覚化するために、この心室注入技術を開発した。

Abstract

胚の脳の発達の間に適切な脳室の形成は正常な脳機能に必要です。脳室は脳脊髄液で満たされている脳内で高度に保存されて空洞です。それは脳室の形成を生じる流体で満たされる間、ゼブラフィッシュでは、神経管形成後に、神経上皮では狭窄やひだのシリーズを受ける。心室形成の過程、および同時に発生する神経上皮の形状の変化を理解するために、我々は、脳組織に比較して心室の領域を可視化する方法が必要でした。しかし、透明なゼブラフィッシュの胚の性質は、それが困難な心室スペースから組織を区別することができます。したがって、我々は、心室のスペースが蛍光色素を充填し、明視野および蛍光顕微鏡によって撮像される脳室注入の技術を開発した。明視野および蛍光イメージは、処理され、Photoshopで重畳されています。この技法は、明視野像における神経上皮の形状と比較して、蛍光色素による心室空間の可視化が可能になります。ゼブラフィッシュの脳室注入は、初期の幼虫の段階を経て18時間後の受精から採用することができます。我々は、脳室の形成と形態形成の我々の研究だけでなく、脳の形態形成変異体（1-3）を特徴付けるに広くこの技術を使用している。

Protocol

プロトコル

パート1：マイクロインジェクションのための準備

1. サターインスツルメンツの針プラーを使用してキャピラリー針を引いて、注射の準備。
2. 蛍光色素（例えばテキサスレッドデキストランなど）を使用してニードルを埋めます。
3. マイクロマニピュレータ及びマイクロインジェクション装​​置で針をマウントします。
4. 斜めの先端を作成するための角度で適切なサイズに針をカット。
5. ドロップサイズを測定し、それがオイルに注入あたり1 2nlの間にあることを確認してください。

パート2：胚の準備

1. 興味の段階より、30分前の胚を注入する。例えば、24時間後に受精（HPF）で心室を勉強するために、23.5 HPFで胚を注入する。キンメルらによれば、胚をステージングします。 （4）。
2. 実体顕微鏡下で、慎重にピンセットを用いて胚から絨毛膜を除去。
3. 1％アガロースでコーティングされたプラスチック製の皿を使用して、プラスチック製の100から200μlをピペットチップでアガロースの穴を突く。慎重にピンセットを用いて穴からアガロースプラグを取り外します。
4. 穴とアガロースの皿に胚のメディアに胚を移す。
5. 胚を麻酔し、実験中に動かないようにするためのメディアにtricaineを（ウェスターフィールド（5）にしたがって作られた）を追加します。
6. ゆっくりと穴に胚の尾部を下にして置かないと、射出装置は胚の後方側になるように向きをそれ。

パート3：脳室に注入する

1. 脳室に注入するために、針の先端がハイパワーでの胚のような視野の同じフィールドになるようにマイクロマニピュレーションのセットアップを手配する。
2. 慎重に下に脳組織を押すことなくr0/r1 hingepointにちょうど後方後脳の細いroofplateを通して針を刺します。
3. だけで十分な染料を完全心室を埋めるために注入する。それは胚の段階に応じて、心室のスペースを埋めるためにいくつかの注射をかかる場合があります。

パート4：イメージング

1. きれいな1％アガロースでコーティングされた皿を使用して、皿に新しい穴を突く、プラグを取り外し、および胚を麻酔し、動きを防ぐために、tricaineを追加。
2. 背側のイメージのための穴と位置に心室注入胚の尾部を置きます。
3. 透過光を使用してイメージを取る。
4. それは、胚や顕微鏡を移動させないことが非常に重要です。
5. 顕微鏡の設定を変更し、蛍光灯を使用してイメージを取る。
6. 透過光と蛍光灯の両方で横方向の画像を撮影する胚を再配置。
7. Photoshopで画像処理のためのTIFFファイルとして画像を保存します。

第5部：画像処理

1. Photoshopで画像を処理するために、透過光と同じ位置で撮影した同じ胚の蛍光画像を開きます。すべての設定は、各画像に対して同じであることを確認してください。
2. 透過光の像にあなたの蛍光画像をドラッグし、それらを正確に並べる。
3. 蛍光画像を選択した状態で、"イメージ、""調整して、選択"し、"色の置き換え"と白に黒の背景を変更。
4. 蛍光画像は、色が均一になるまで"置換色"ウィンドウの右側に"あいまいさ"の要因を調整します。
5. "レイヤー"ウィンドウで、オーバーレイイメージを表示するには、"乗算"を選択します。あなたの脳室空間のイメージが正確に透過光の像を一致させる必要があります。
6. 他の画像については、このファイルと繰り返しを保存します。

代表的な結果/成果

誤った注入の画像の例はEHに示されている間は、適切な心室の注入イメージは、図1のパネルのADに示されています。適切な注射はシャープなエッジと非拡散色素を持っている。針を心室に遠く挿入されたときに発生すると、以下の脳組織に当たる誤った注射は、、心室スペースの外に目に見えると卵黄にある色素になる可能性があります。

図1。 25 HPF野生型の胚の心室注射。（AD）正しい注射方法と（EH）不正な注入方法は、例として示されています。対応する蛍光像（B、F）と示される正しいと誤った注入法の両方の蛍光と明視野画像（C、G）のオーバーレイと（、E）背明視野像。矢印は、染料が正しくない心室インジェクション（"トラブルシューティング"を参照）に起因する脳室の空間を超えてしまった領域を示している。前方には、すべての画像の左側にあります。

トラブルシューティング：

問題が原因と	救済策
あなたは針で胚を押しつぶしている。	あなたの針は、あまりにも鈍さや先端が大きすぎる。	新しい針で起動し、それをさかのぼっ損ないません。ベベルは、針注射器の針のようにそれがシャープにする。
染料は、胚と卵黄を通してである（図1E - H参照）。	あなたの針は、組織を経て心室空間に滞在していない。	あなたの針が十分にシャープではないかもしれない、あなたが穿刺の速度を制御することができないので。
染料は、前脳であまりにもかすかなかではありません。	あなたは、注射のための十分に高い圧力を使用していない、またはあなたの針が十分では、色素を注入するときに脳に到達する前ではなかった。	あなたの射出圧力を増加したり、針がわずかに前方に注入中に置きます。より詳細な情報が脳に必要な場合には、中脳後脳境界を通して針を置くことができます。また、単に画像処理の前にさらに拡散するために染料のためのビットを待つことができます。
あなたの蛍光画像は、Photoshopで色置換後のエッジの周りに暗いです。	あなたは、色の置換]ウィンドウで、"あいまいさ"の設定を変更するのを忘れ。	"曖昧さの"カラーの置換]ウィンドウの右端まで移動します。
針は、穿刺後脳のroofplateをしません。	あなたの針が適切にカットされていません。	新しい針を作る。あなたが注射をたくさんやっている場合はそれらが鈍い得ることができるように、いくつかの針が必要になる場合があります。

Discussion

このビデオでは、ゼブラフィッシュの脳室の開発に蛍光色素（テキサスレッドデキストラン）を注入する方法を示しています。このメソッドは、周囲の神経上皮とは対照的に、脳室のスペースを視覚化するために使用し、心室空間の形状だけでなく、周囲の脳組織の形状を決定するための非常に便利です。それは、私たちはより良い生きている胎児の時間をかけて脳室の形成と脳の形態形成の過程を理解することができます。この手法は、脳室の形成の欠陥を研究するためと初期特性と脳の形態形成突然変異体の研究のための優れたツールです。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	Tool	Fine Science Tools	11252-20
Capillary Tubes (needles)	Tools	Frederick Haer and Co.	30-30-1
Agarose-Coated dishes	Tools	Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning)	Agarose (50027) Dishes (430166)	Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting
Dissecting Microscope	Microscope	Carl Zeiss, Inc.
Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software	Tools
1-200 μ pipette tips	Tools	USA Scientific, Inc.	1111-0806	These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly.
Photoshop	Image Analysis	Adobe
Embryo Loop	Tools			Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax.
Microinjector	Tools	Harvard Apparatus	PL1-100
Needle Puller	Tools	Sutter Instrument Co.		Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70).
Micromanipulator	Tools	Narishige International
Fluorescent dye Texas-Red Dextran 70,000MW	Reagent	Molecular Probes, Life Technologies	D1830	Other Molecular weights are available if desired.
Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester)	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5040
Embryo Media	Reagent			According to Westerfield (5)