Zebrafish Injection Ventrículo Cerebral

Summary

Após a formação do tubo neural, o neuroepitélio contrai e dobras, enquanto o tubo se enche de líquido cefalorraquidiano embrionárias (eCSF) para formar os ventrículos do cérebro embrionário. Nós desenvolvemos esta técnica de injeção do ventrículo para visualizar melhor o espaço cheio de líquido, em contraste com a forma neuroepiteliais em um embrião vivo.

Abstract

Formação adequada do ventrículo do cérebro durante o desenvolvimento embrionário do cérebro é necessário para a função cerebral normal. Ventrículos cerebrais são as cavidades altamente conservadas dentro do cérebro que são preenchidos com fluido cerebrospinal. Em peixes-zebra, após a formação do tubo neural, o neuroepitélio sofre uma série de constrições e dobras, enquanto ele se enche de fluido, resultando na formação de ventrículo cerebral. A fim de compreender o processo de formação do ventrículo, e as mudanças que ocorrem neuroepiteliais forma, ao mesmo tempo, precisávamos de uma forma de visualizar o espaço do ventrículo em comparação com o tecido cerebral. No entanto, a natureza de embriões zebrafish transparente torna difícil diferenciar o tecido do espaço ventrículo. Por isso, desenvolvemos uma técnica de injeção ventrículo cerebral onde o espaço de ventrículo é preenchido com um corante fluorescente e fotografada pela claro e microscopia de fluorescência. O claro e as imagens fluorescentes são então processadas e sobrepostos no Photoshop. Esta técnica permite a visualização do espaço do ventrículo com o corante fluorescente, em comparação com a forma do neuroepitélio na imagem de campo claro. Injeção cérebro ventrículo no peixe-zebra pode ser empregado a partir de 18 horas após a fecundação até o início fases larval. Temos utilizado esta técnica extensivamente em nossos estudos de formação do cérebro do ventrículo e morfogênese, bem como na caracterização de mutantes cérebro morfogênese (1-3).

Protocol

Protocolo

Parte 1: Preparando-se para microinjeção

1. Prepare-se para a injeção puxando agulhas capilar utilizando Sutter extrator de agulhas Instruments.
2. Preencha a agulha com um corante fluorescente (como Texas Red-Dextran).
3. Montar a agulha em um aparelho de microinjeção e micromanipulador.
4. Cortar a agulha para o tamanho apropriado em um ângulo para criar uma ponta chanfrada.
5. Medir o tamanho de gota e verifique se ele está entre 1-2nl por injecção de óleo.

Parte 2: Preparando os embriões

1. Injetar os embriões 30 minutos mais cedo do que o estágio de interesse. Por exemplo, para estudar os ventrículos menos 24 horas após a fertilização (hpf), injetar os embriões em 23,5 hpf. Estágio os embriões de acordo com Kimmel et al. (4).
2. Sob o estereomicroscópio, remova cuidadosamente o córion dos embriões usando uma pinça.
3. Usando um prato de plástico revestidas com agarose 1%, poke buracos na agarose com uma ponteira de plástico 100-200 mL. Remova cuidadosamente os plugues de agarose dos furos usando uma pinça.
4. Transferência de embriões em meios embrião no prato agarose com buracos.
5. Adicionar tricaina (feita de acordo com Westerfield (5)) para a mídia para anestesiar os embriões e evitar qualquer movimento durante o experimento.
6. Delicadamente, coloque a cauda do embrião para dentro do buraco, e orientá-la de modo que o aparelho de injecção está no lado posterior do embrião.

Parte 3: A injeção do ventrículo cerebral

1. Para injetar o ventrículo cerebral, providenciar a instalação de micromanipulação de modo que a ponta da agulha está no mesmo campo de visão como o embrião em potência alta.
2. Cuidadosamente coloque a agulha através da roofplate fina do rombencéfalo apenas posterior à hingepoint r0/r1 sem bater o tecido cerebral abaixo.
3. Apenas o suficiente injetar corante para encher completamente os ventrículos. Pode levar várias injeções para preencher o espaço ventrículo, dependendo do estágio do embrião.

Parte 4: Imaging

1. Usando um limpa 1% agarose prato revestido, poke novos buracos no prato, retire as velas, e adicione tricaina para anestesiar os embriões e impedir o movimento.
2. Coloque a cauda do embrião ventrículo-injetado no buraco e posição para uma imagem dorsal.
3. Tirar uma foto usando luz transmitida.
4. É muito crítico para não mover o embrião ou microscópio.
5. Alterar as configurações no microscópio e ter uma imagem com luz fluorescente.
6. Reposicionar o embrião para tirar fotos com os dois laterais luz transmitida e luz fluorescente.
7. Guardar as imagens como arquivos TIFF para processamento de imagens em Photoshop.

Parte 5: Processamento de Imagem

1. Para processar as imagens no Photoshop, abra a luz transmitida e luz fluorescente imagens do embrião mesmo tomadas na mesma posição. Certifique-se de todas as configurações são as mesmas para cada imagem.
2. Arraste a imagem fluorescentes para a imagem de luz transmitida e alinhá-las com exatidão.
3. Com a imagem selecionada fluorescentes, selecione "Imagem", "Ajustes," e depois "Substituir cor" e mudar o fundo preto ao branco.
4. No "Substituir cor" janela ajustar a "imprecisão" fator para a direita até as imagens fluorescentes parece uniforme em cor.
5. No "Layers" janela, selecione "Multiply" para ver as imagens de sobreposição. Sua imagem de espaço ventrículo deve corresponder à imagem de luz transmitida com exatidão.
6. Salve este arquivo e repita para quaisquer outras imagens.

Resultados representante / Resultado

Adequada imagens injeção ventrículo são mostrados na Figura 1 AD painéis, enquanto um exemplo de imagens de injeção incorreta são mostrados na EH. Injeções adequada têm arestas vivas e não-difusa corante. Injeção incorreta, que ocorre quando a agulha é inserida longe demais para o ventrículo e atinge o tecido cerebral abaixo, pode resultar em corante que é visível fora do espaço ventrículo e na gema.

Figura 1. Ventrículo injeções de 25 hpf embriões de tipo selvagem. (AD) método de injeção correta e (EH) método de injeção incorreta são mostrados como exemplos. (A, E) imagens brightfield dorsal com correspondentes imagens fluorescentes (B, F) ea sobreposição das imagens fluorescentes e brightfield (C, G) para métodos de injeção corretas e incorretas mostrado. Setas indicam regiões onde corante foi além do espaço do ventrículo cerebral devido a uma injeção ventrículo incorreta (consulte "Solução de problemas"). Anterior é para a esquerda em todas as imagens.

Solução de problemas:

Problema Causa	Remédio
Você está esmagando o embrião com a agulha.	Sua agulha é demasiado brusco ou a ponta é muito grande.	Comece com uma agulha nova e não quebrá-lo, tanto para trás. Bisel da agulha para torná-lo seu afiada como uma agulha de seringa.
O corante é em todo o embrião e da gema (ver Fig. 1E-H).	Sua agulha atravessou o tecido e não ficar no espaço ventrículo.	A agulha não pode ser afiado o suficiente, então você é incapaz de controlar a velocidade de punção.
O corante é muito fraco ou não na parte frontal do cérebro.	Você não usar uma pressão alta o suficiente para a injeção, ou a agulha não foi longe o suficiente para alcançar o anterior do prosencéfalo quando injetado o corante.	Aumentar a sua pressão de injeção ou colocar a agulha um pouco mais durante a injeção anterior. Você pode colocar a agulha através da fronteira mesencéfalo rombencéfalo-se mais detalhe é necessário no prosencéfalo. Você também pode simplesmente esperar um pouco para o corante para difundir ainda mais antes de imagem.
Suas imagens fluorescentes são escuras em torno das bordas após a substituição de cores no Photoshop.	Você se esqueceu de mudar a "confusão" na janela de configuração substitui a cor.	Mover a "confusão" por todo o caminho à direita na janela de substituição de cor.
A agulha não perfurar a roofplate rombencéfalo.	A agulha não é cortado corretamente.	Faça uma nova agulha. Se você estiver fazendo um monte de injeções que você pode precisar de várias agulhas como eles podem obter maçante.

Discussion

Neste vídeo demonstramos como injetar corante fluorescente (Texas-Red Dextran) no desenvolvimento de ventrículos cerebrais zebrafish. Este método é usado para visualizar o espaço do ventrículo cerebral em contraste com a neuroepitélio circundante e é extremamente útil para determinar a forma do espaço ventrículo, bem como a forma do tecido cerebral circundante. Ela nos permite compreender melhor o processo de formação do cérebro e morfogênese do ventrículo cerebral ao longo do tempo no embrião vivo. Esta técnica é uma excelente ferramenta para o estudo de defeitos no cérebro e para a formação do ventrículo caracterização inicial e estudo de mutantes morfogênese cerebral.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	Tool	Fine Science Tools	11252-20
Capillary Tubes (needles)	Tools	Frederick Haer and Co.	30-30-1
Agarose-Coated dishes	Tools	Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning)	Agarose (50027) Dishes (430166)	Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting
Dissecting Microscope	Microscope	Carl Zeiss, Inc.
Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software	Tools
1-200 μ pipette tips	Tools	USA Scientific, Inc.	1111-0806	These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly.
Photoshop	Image Analysis	Adobe
Embryo Loop	Tools			Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax.
Microinjector	Tools	Harvard Apparatus	PL1-100
Needle Puller	Tools	Sutter Instrument Co.		Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70).
Micromanipulator	Tools	Narishige International
Fluorescent dye Texas-Red Dextran 70,000MW	Reagent	Molecular Probes, Life Technologies	D1830	Other Molecular weights are available if desired.
Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester)	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5040
Embryo Media	Reagent			According to Westerfield (5)