En hög genomströmning metod för att globalt studera organell morfologi i S. cerevisiae

Summary

GFP-fusionsproteiner används ofta för att visualisera organeller av konfokalmikroskopi. Kräver dock screening för mutationer som påverkar morfologi av organeller i allmänhet enskilda mutagenes och är tidskrävande. Här visar vi en metod att samtidigt införliva organell-GFP markörer i nästan 5000 icke väsentliga gener i jäst.

Abstract

Hög kapacitet metoder för att undersöka protein lokalisering eller organell morfologi är ett effektivt verktyg för att studera protein interaktioner och kan bidra till att uppnå en övergripande förståelse av molekylära vägar. I Saccharomyces cerevisiae, med utvecklingen av den icke-väsentliga gendeletion array, kan vi studera globalt morfologi av olika organeller såsom det endoplasmatiska retiklet (ER) och mitokondrier med GFP (eller variant)-markörer i olika gen bakgrund. Är dock att införliva GFP markörer i varje enskild mutant sig en arbetsintensiv process. Här beskriver vi en procedur som rutinmässigt används i vårt laboratorium. Genom att använda ett robotsystem för att hantera hög densitet jäst arrayer och droger tekniker urval, kan vi förkorta avsevärt den tid som krävs och förbättra reproducerbarhet. I korthet, korsar vi en GFP-märkta mitokondriella markör (Apc1-GFP) till en hög densitet rad 4672 onödiga mutanter gendeletion av robotliknande kopia nåla. Genom diploid urval, sporulering, groning och dubbla markör val återhämta vi båda alleler. Som ett resultat, innehåller varje haploida enda mutant Apc1-GFP införlivas på sin genomiska locus. Nu kan vi studera morfologi av mitokondrier i alla icke-väsentliga mutant bakgrund. Med denna hög genomströmning arbetssätt kan vi studera bekvämt och avgränsa vägar och gener inblandade i arv och bildandet av organeller i en genomet hela inställningen.

Protocol

Material och metoder:

1. Jäststammar:
   • Acp1-GFP (GFP:: Hans): C-terminal GFP-märkning av Acp1 genererades av en PCR-medierad homolog rekombination med hjälp av plasmid pKT128 (innehåller GFP och HIS5). Positiva transformants bekräftades av konfokalmikroskopi och koloni PCR. Stammen Bakgrunden var BY7043 (MAT alpha can1Δ:: STE2pr-lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0) från Boone lab (Tong och Boone, 2006).
   • Borttagande Mutant Array (DMA) (xxx:: KanR): Det är en samling av ca 5000 radering mutanter av icke-väsentliga gener. Alla dessa onödiga gener slogs ut på G418. Stammen bakgrund matrisen är BY4741 (MATA his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0). Vår DMA ursprungligen från Boone lab.
2. Införliva Acp1-GFP i DMA:
   
   Följande protokoll för att göra en GFP array är anpassat från den Syntetiska genetisk analys (SGA) teknik (Tong och Boone, 2006) med ändringar. Alla replik sätter stegen görs med hjälp av en Singer ROTOR hög densitet arraying robotsystem. Alternativt kan manuell fastlåsning eller en vätska baserad hög densitet arraying roboten användas.
   
   Akronymer: YPD, jästextrakt-pepton-dextros, SD, syntetiska bortfall, LRK, Lue / Arg / Lys hoppar av media, LHRK, Lue / Hans / Arg / Lys bortfall medier
   
   Förberedelser
   1. Odla en gräsmatta av Acp1-GFP celler genom att hälla en 5 ml av natten Acp1-GFP kulturen på en YPD tallrik. Låt plattan torka tillräckligt av en låga eller i ett biologiskt dragskåp.
   2. Inkubera plattan vid 30 ˚ C över natten.
   3. Med hjälp av en robot, array Acp1-GFP sila upp i 1536 kolonier per platta. Samtidigt förbereder en ny kopia av DMA med repliken nåla till YPD + G418 plattor.
   4. Inkubera plattorna vid 30 ˚ C över natten.
      
      Parning och diploida val
      
      
   5. Mate de Acp1-GFP stam med DMA med repliken nåla och över-lägga kolonier på YPD tallrikar.
   6. Inkubera plattorna vid 30 ˚ C över natten.
   7. Replica-platta kolonierna på SD - Hans + G418 plattor att välja diploida celler (MATA / MATalpha).
   8. Inkubera plattorna vid 30 ˚ C över natten.
      
      Sporulationg och groning
      
      
   9. Replica-platta den diploida kolonier om förbättrad sporulering medier, som innehåller sänkta nivåer av kol och kväve källor för att påverka uppkomsten av meiotiska sporer.
   10. Inkubera plattorna vid 25 ˚ C i minst 5 dagar.
   11. Gro Mata meiotiska avkommor med replika-plating kolonierna på LRK media och Inkubera plattorna vid 30 ˚ C i två dagar.
   12. Denna media kommer att inducera groning av haploida celler från sporer. Eftersom en LUE2 öppning läsram (ORF) är integrerade på Mata-specifika STE2 promotor kommer alla grodde haploids vara Mata.
       
       Val av båda allelerna
       
       
   13. Det är nu nödvändigt att välja både GFP-allel och den enda mutant allel. För att åstadkomma detta, Mata celler replika-klädd på LRK + G418 media som väljer att haploida celler som bär på genen borttagning (xxx:: kanR).
   14. Inkubera plattorna vid 30 ˚ C över natten.
   15. Slutligen Mata meiotiska avkommor är replika-klädd på LHRK + G418 medier att välja för tillväxt av enstaka mutanter (xxx:: kanR) också hyser Acp1-GFP (GFP:: Hans). Dessa skyltar kan lagras vid 4 ˚ C upp till 3 månader.
   
   
   Följande protokoll för att göra en GFP array är anpassat från den Syntetiska genetisk analys (SGA) teknik (Tong och Boone, 2006) med ändringar. Alla replik sätter stegen görs med hjälp av en Singer ROTOR hög densitet arraying robotsystem. Alternativt kan manuell fastlåsning eller en vätska baserad hög densitet arraying roboten användas.
   
   Akronymer: YPD, jästextrakt-pepton-dextros, SD, syntetiska bortfall, LRK, Lue / Arg / Lys hoppar av media, LHRK, Lue / Hans / Arg / Lys bortfall medier
   
   Förberedelser
3. Mikroskopi:
   1. Välj önskad mutant (s) uttrycker Acp1-GFP direkt från plattan.
   2. Odla cellerna vid 30 ° C i YPD eller SD - Hans media för att tidigt logga fas.
   3. Visualisera med konfokalmikroskopi hjälp av GFP filterset. Ett exempel på förväntat resultat är att visa i figur 1.

SGA media:

Tillväxten media (YPD) och välja media (SD) som används i detta protokoll används rutinmässigt i jäst molekylärbiologi. Se Metoder i jäst (Amberg et al., 2005) för detaljerade beskrivningar.

LRK, LHRK media (400 ml totalt)

Lägg i syfte	Belopp
Jäst kvävehaltiga bas med ammoniumsulfat	2,7 g
AminosyraBlanda	0,8 g
Agar	8 g
dH 2 O	360 ml
Autoklav
20% glukoslösning	40 ml
Kyl till 65 ˚ C
100 mg / ml canavanine	0,2 ml
100 mg / ml thialysine	0,2 ml
Blanda, häll 50 ml per platta

LRK, LHRK + G418 media (400 ml totalt)

Lägg i syfte	Belopp
Jäst kvävehaltiga bas utan ammoniumsulfat	0,7 g
Aminosyra mix	0,8 g
Mononatriumglutamat	0,4
Agar	8 g
dH 2 O	360 ml
Autoklav
20% glukoslösning	40 ml
Kyl till 65 ˚ C
100 mg / ml canavanine	0,2 ml
100 mg / ml thialysine	0,2 ml
200 mg / ml G418	0,4 ml
Blanda, häll 50 ml per platta

Berikad sporulering media (400 ml totalt)

Lägg i syfte	Belopp
Kaliumacetat	4 g
Jästextrakt	0,4 g
Dextros	0,2 g
Sporulering aminosyra mix	0,04 g
Agar	8 g
dH 2 O	360 ml
Autoklav
Kyl till 65 ˚ C
200 mg / ml G418	0,4 ml
Blanda, häll 50 ml per platta

Discussion

Denna metod kan hjälpa effektivt införliva en mitokondriell markör, Acp1-GFP i olika muterade bakgrunder. Det bygger på användning av ett robotsystem, och kan enkelt antagits för användning med någon robotsystem. Detta förfarande kan även användas för att införa andra typer av markörer. Till exempel att visualisera ER använder vi rutinmässigt markören Erg11-GFP. I vår representativa bilder, en mutant och en vild typ med Acp1-GFP skapare var visualiz ed av konfokalmikroskopi att studera mitokondrier morfologi. Den muterade visade störde mitokondrie-fenotyp, och är därför en bra kandidat för vidare utredning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SGA media			The growth media (YPD) and synthetic dropout media (SD) including LRK and LHRK, and enriched sporulation media used in this protocol is routinely used in yeast molecular biology. Please refer to Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) for detailed descriptions.