S. cerevisiae "adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

Summary

GFP-füzyon proteinleri yaygın konfokal mikroskobi organelleri görselleştirmek için kullanılır. Ancak, genellikle bireysel mutagenez organellerin morfolojisini etkileyen mutasyonlar için tarama gerektirir ve zaman alıcıdır. Burada, neredeyse 5.000 maya gerekli olmayan genlerin aynı anda organel-GFP işaretleri dahil etmek için bir yöntem göstermektedir.

Abstract

Protein lokalizasyon veya organel morfolojisi incelemek için yüksek verimlilik yöntemleri protein etkileşimleri çalışmak için etkili bir araçtır ve moleküler yollarının kapsamlı bir anlayış elde etmenize yardımcı olabilir. Saccharomyces cerevisiae, zorunlu olmayan gen silme dizi gelişme, global olarak endoplazmik retikulum (ER) ve mitokondri kullanarak GFP (veya türevi) belirteçlerinin farklı gen geçmişleri gibi farklı organellerin morfoloji eğitim görebilirsiniz. Ancak, tek tek her mutant içeren GFP işaretleri, ayrı ayrı emek-yoğun bir süreçtir. Burada, bizim laboratuvarda rutin olarak kullanılan bir prosedür açıklanmaktadır. Yüksek yoğunluklu maya dizileri ve ilaç seçimi teknikleri işlemek için bir robot sistemi kullanarak, önemli ölçüde zaman gerekli kısaltmak ve tekrarlanabilirlik geliştirmek. Kısacası, biz robot çoğaltma iğneleyerek 4672 gerekli olmayan gen silme mutant bir yüksek yoğunluklu bir dizi GFP etiketli mitokondriyal bir işaretleyici (Apc1 GFP) kesişir. Diploid seçimi, sporlanma, çimlenme ve çift işaretleyici seçimi sayesinde, her iki allel kurtarabilirsiniz. Sonuç olarak, her haploid tek mutant Apc1-GFP genomik lokustaki dahil içerir. Şimdi, biz, gerekli olmayan tüm mutant arka planda mitokondri morfolojisi eğitim görebilirsiniz. Bu yüksek verimlilik yaklaşımı kullanarak, uygun bir çalışma ve genom bir ortamda miras ve organellerin oluşumu ilgili yollar ve genler tasvir.

Protocol

Gereç ve yöntem:

1. Maya suşları:
   • Acp1-GFP (GFP:: His): Acp1 C-terminali, GFP-etiketleme plazmid pKT128 (GFP ve HIS5 içerir) kullanarak PCR-aracılı homolog rekombinasyon tarafından oluşturulan oldu. Pozitif transformants konfokal mikroskopi ve koloni PCR tarafından teyit edildi. Boone laboratuarı (Tong ve Boone, 2006): suşu arka plan BY7043 (STE2pr lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 MAT alfa can1Δ).
   • Silme Mutant Array (DMA) (xxx:: KanR): gerekli olmayan genlerin yaklaşık 5.000 silme mutant bir dizidir. Tüm bu gerekli olmayan genlerin G418 elendikçe. Dizinin gerginlik arka plan BY4741 (Mata his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0). Bizim DMA orijinal Boone laboratuvarı oldu.
2. DMA Acp1-GFP ekleme:
   
   GFP dizi yapmak için aşağıdaki protokol değişiklikleri ile Sentetik Genetik Analizi (SGA) teknolojisi (Tong ve Boone, 2006) uyarlanmıştır. Tüm çoğaltma çivileme adımları, robotik sistem arraying Şarkıcı ROTOR yüksek yoğunluklu kullanılarak yapılır. Alternatif olarak, manuel çivileme veya sıvı bazlı, yüksek yoğunluklu arraying robot kullanılıyor olabilir.
   
   Kısaltmalar: YPD, maya özü-pepton-dekstroz, SD, sentetik okulu terk etme; lrk, Lue / Arg / Lys okulu terk medya; LHRK, Lue / His / Arg / Lys okulu terk medya
   
   Hazırlık
   1. Acp1-GFP hücrelerinin gecede Acp1 GFP kültürünün bir 5 ml YPD bir plaka üzerine dökerek bir çim büyütün. Plaka alev veya biyolojik bir davlumbaz yeterince kurumasını bekleyin.
   2. 30 ˚ C gecede plaka inkübe edin.
   3. Plaka başına 1536 koloniler halinde bir robot, dizi Acp1-GFP gerginlik kullanma. Aynı zamanda, çoğaltma YPD + G418 plakaları iğneleyerek DMA yeni bir kopyasını hazırlayın.
   4. 30 ˚ C gecede plakaları inkübe edin.
      
      Çiftleşme ve diploid seçimi
      
      
   5. DMA ile çoğaltma çivileme ve YPD plakalar üzerinde koloniler döşeme Acp1 GFP gerginlik Mate.
   6. 30 ˚ C gecede plakaları inkübe edin.
   7. Diploid hücrelerinde (Mata / MATalpha) seçmek için O'nun + G418 plakaları üzerine SD Replica plakalı koloniler.
   8. 30 ˚ C gecede plakaları inkübe edin.
      
      Sporulationg ve Çimlenme
      
      
   9. Mayotik sporların oluşumunu uyarmak için karbon ve azot kaynakları azalmış seviyeleri içeren gelişmiş sporlanma medya Replica plakalı diploid koloniler.
   10. 25 ˚ C'de 5 gün en az plakalar inkübe edin.
   11. Lrk medya üzerine çoğaltma kaplama kolonileri Mata mayotik yavrularıyla filizleneceği ve plakalar 30 ˚ C iki gün kuluçkaya yatmaktadır.
   12. Bu medya sporlar haploit hücreler çimlenme neden olacaktır. LUE2 açılış okuma kare (ORF) Mata özel STE2 organizatörü entegre olduğundan, çimlenmiş tüm haploids Mata olacak.
       
       Her iki allel Seçimi
       
       
   13. Şimdi GFP allel ve tek mutant allel seçmek için gerekli. Bunu başarmak için, Mata hücreleri çoğaltma gen delesyon (xxx:: kanR) taşıyan haploit hücreler için seçer lrk + G418 medya, üzerine kaplama.
   14. 30 ˚ C gecede plakaları inkübe edin.
   15. Son olarak, Mata mayotik yavrularıyla çoğaltma kaplama tek mutantlar büyüme (xxx: kanR:) seçmek için LHRK + G418 medya üzerine de Acp1-GFP barındıran (GFP:: His). Bu plakalar, 4 ˚ C, 3 ay kadar saklanabilir.
   
   
   GFP dizi yapmak için aşağıdaki protokol değişiklikleri ile Sentetik Genetik Analizi (SGA) teknolojisi (Tong ve Boone, 2006) uyarlanmıştır. Tüm çoğaltma çivileme adımları, robotik sistem arraying Şarkıcı ROTOR yüksek yoğunluklu kullanılarak yapılır. Alternatif olarak, manuel çivileme veya sıvı bazlı, yüksek yoğunluklu arraying robot kullanılıyor olabilir.
   
   Kısaltmalar: YPD, maya özü-pepton-dekstroz, SD, sentetik okulu terk etme; lrk, Lue / Arg / Lys okulu terk medya; LHRK, Lue / His / Arg / Lys okulu terk medya
   
   Hazırlık
3. Mikroskopi:
   1. Plaka doğrudan Acp1-GFP ifade eden istenen mutant (ler) seçin.
   2. 30 hücreleri büyütün ° C - YPD veya SD erken log fazı olan medya.
   3. GFP filterset kullanarak konfokal mikroskobu ile gözünüzde canlandırın. Beklenen bir sonuç bir örnek Şekil 1'de gösterilir.

SGA medya:

Bu protokolde kullanılan büyüme ortam (YPD) ve seçme medya (SD) rutin maya moleküler biyoloji kullanılır. Lütfen detaylı açıklamaları için (Amberg ve ark, 2005) Maya Yöntemleri bakın.

Lrk, LHRK medya (toplam 400 ml için)

Amacıyla ekle	Miktar
Maya amonyum sülfat ile azotlu baz	2.7 g
Amino asitkarışım	0.8 g
Agar	8 g
dH 2 O	360 mL
Otoklav
20% Dekstroz	40 ml
65 Soğuk ˚ C
100 mg / ml canavanine	0.2 ml
100 mg / ml thialysine	0.2 ml
Mix, plaka başına 50 ml dökün

Lrk, LHRK + G418 medya (toplam 400 ml için)

Amacıyla ekle	Miktar
Amonyum sülfat olmadan Maya azotlu baz	0.7 g
Amino asit karışımı	0.8 g
Monosodyum Glutamat	0,4
Agar	8 g
dH 2 O	360 mL
Otoklav
20% Dekstroz	40 ml
65 Soğuk ˚ C
100 mg / ml canavanine	0.2 ml
100 mg / ml thialysine	0.2 ml
200 mg / ml G418	0.4 ml
Mix, plaka başına 50 ml dökün

Zenginleştirilmiş sporlanma medya (toplam 400 ml için)

Amacıyla ekle	Miktar
Potasyum asetat	4 g
Maya özü	0.4 g
Dekstroz	0.2 g
Sporlanma amino asit karışımı	0,04 g
Agar	8 g
dH 2 O	360 mL
Otoklav
65 Soğuk ˚ C
200 mg / ml G418	0.4 ml
Mix, plaka başına 50 ml dökün

Discussion

Bu yöntem çeşitli mutant arka planla mitokondriyal marker, Acp1-GFP dahil verimli bir şekilde yardımcı olabilir. Robotik bir sistem kullanımına dayanır ve herhangi bir robot sistemi ile kullanmak için kolayca kabul edebilir. Bu işlem aynı zamanda belirteç diğer türleri birleştiren için kullanılabilir. Örneğin, ER görselleştirmek için, rutin marker Erg11-GFP kullanabilirsiniz. Temsili görüntü, bir mutant ve Acp1-GFP yapımcısı ile vahşi bir türü visualiz ed mitokondri morfolojisi çalışma konfokal mikroskobu ile. Mutant kesintiye mitokondriyal fenotip gösterdi ve bu nedenle daha fazla araştırma için iyi bir aday.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SGA media			The growth media (YPD) and synthetic dropout media (SD) including LRK and LHRK, and enriched sporulation media used in this protocol is routinely used in yeast molecular biology. Please refer to Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) for detailed descriptions.