Un high-throughput metodo per studiare la morfologia globale organello in S. cerevisiae

Summary

GFP-fusion proteine ​​sono ampiamente utilizzati per visualizzare organelli mediante microscopia confocale. Tuttavia, lo screening per le mutazioni che influenzano la morfologia degli organelli generalmente richiede mutagenesi individuale e richiede molto tempo. Qui, dimostriamo un metodo per integrare simultaneamente organello-GFP marcatori in quasi 5.000 non essenziali geni nel lievito.

Abstract

High-throughput metodi per esaminare la localizzazione di proteine ​​o morfologia organello è uno strumento efficace per studiare le interazioni delle proteine ​​e può aiutare a raggiungere una comprensione completa delle vie molecolari. In Saccharomyces cerevisiae, con lo sviluppo del non essenziali serie gene cancellazione, siamo in grado di studiare a livello globale la morfologia degli organelli diversi, come il reticolo endoplasmatico (ER) e la GFP mitocondri utilizzando (o variante)-marcatori in geni diversi contesti. Tuttavia, i marcatori GFP incorporando in ogni singolo mutante è individualmente un lavoro processo ad alta intensità. Qui, descriviamo una procedura che viene normalmente utilizzato nel nostro laboratorio. Utilizzando un sistema robotico per gestire array ad alta densità di lievito e le tecniche di selezione dei farmaci, siamo in grado di ridurre significativamente il tempo richiesto e migliorare la riproducibilità. In sintesi, attraversiamo un GFP-tagged marcatore mitocondriale (Apc1-GFP) ad un alta densità serie di 4.672 mutanti delezione del gene non essenziale dalla robotica replica pinning. Attraverso la selezione diploide, sporulazione, germinazione e la selezione marcatore duale, abbiamo recuperare entrambi gli alleli. Come risultato, ogni mutante aploide singolo contiene Apc1-GFP incorporato al suo locus genomico. Ora, possiamo studiare la morfologia dei mitocondri in tutti i non essenziali sfondo mutante. Utilizzando questo approccio high-throughput, possiamo comodamente studiare e delineare i percorsi e geni coinvolti nella eredità e la formazione di organelli in un genoma impostazione.

Protocol

Materiali e metodi:

1. Ceppi di lievito:
   • Acp1-GFP (GFP:: Il suo): C-terminale GFP-tagging delle Acp1 è stato generato da una PCR-mediata mediante ricombinazione omologa pKT128 plasmide (GFP e contiene HIS5). Trasformanti positivi sono stati confermati mediante microscopia confocale e colonia PCR. Lo sfondo ceppo è stato BY7043 (MAT alfa can1Δ:: STE2pr-lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0) da Boone laboratorio (Tong e Boone, 2006).
   • Cancellazione Array Mutant (DMA) (xxx:: KanR): si tratta di una serie di circa 5.000 mutanti di delezione di geni non essenziali. Tutti questi geni non essenziali sono stati eliminati il ​​G418. Lo sfondo deformazione della matrice è BY4741 (Mata his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0). Il nostro DMA era originario di Boone laboratorio.
2. Incorporando Acp1-GFP nel DMA:
   
   Il protocollo seguito per fare una serie GFP è adattato dal Analisi sintetica genetica (SGA) tecnologia (Tong e Boone, 2006) con modifiche. Tutti i passaggi pinning replica sono fatte utilizzando un rotore Singer ad alta densità arraying sistema robotico. In alternativa, manuale pinning o una base liquida ad alta densità di robot arraying possono essere utilizzati.
   
   Acronimi: YPD, estratto-peptone-destrosio lievito, SD, di abbandono di sintesi; LRK, Lue / Arg / Lys abbandono dei media; LHRK, Lue / suo / Arg / Lys abbandono dei media
   
   Preparazione
   1. Crescere un prato di Acp1-GFP cellule versando a 5 ml di notte Acp1-GFP cultura su un piatto YPD. Lasciare seccare la lastra a sufficienza da una fiamma o in una cappa aspirante biologico.
   2. Incubare la piastra a 30 ˚ C durante la notte.
   3. Uso di un array di robot Acp1-GFP versare nel 1536 colonie per piastra. Allo stesso tempo, preparare una nuova copia del DMA replica da appuntare al YPD + piastre G418.
   4. Incubare le piastre a 30 ˚ C durante la notte.
      
      Accoppiamento e selezione diploide
      
      
   5. I-Mate Acp1 GFP ceppo con la DMA di replica pinning e oltre-che le colonie su piastre YPD.
   6. Incubare le piastre a 30 ˚ C durante la notte.
   7. Replica piastra le colonie su SD - I suoi piatti G418 + per selezionare le cellule diploidi (Mata / MATalpha).
   8. Incubare le piastre a 30 ˚ C durante la notte.
      
      Sporulationg e germinazione
      
      
   9. Replica piastra le colonie diploide su supporti sporulazione maggiore, che contiene livelli ridotti di fonti di carbonio e di azoto per indurre la formazione di spore meiotico.
   10. Incubare le piastre a 25 ˚ C per un minimo di 5 giorni.
   11. Germinare la progenie MATA meiotico di replica-plating le colonie su LRK media e incubare le piastre a 30 ˚ C per due giorni.
   12. Questo supporto sarà indurre la germinazione delle cellule aploidi dalle spore. Dal momento che un LUE2 quadro di lettura di apertura (ORF) è integrato al MATA specifico promotore STE2, tutti i haploids germinato sarà Mata.
       
       Selezione di entrambi gli alleli
       
       
   13. Ora è necessario selezionare sia l'allele GFP e il singolo allele mutante. Per fare questo, le cellule sono MATA replica placcata su LRK + G418 media, che sceglie di cellule aploidi che portano la delezione del gene (xxx:: kanR).
   14. Incubare le piastre a 30 ˚ C durante la notte.
   15. Infine, la progenie MATA meiotico sono placcati in replica su LHRK + G418 Media per selezionare per la crescita dei singoli mutanti (xxx:: kanR) anche ospitare Acp1-GFP (GFP:: Il suo). Queste placche possono essere conservati a 4 ˚ C per un massimo di 3 mesi.
   
   
   Il protocollo seguito per fare una serie GFP è adattato dal Analisi sintetica genetica (SGA) tecnologia (Tong e Boone, 2006) con modifiche. Tutti i passaggi pinning replica sono fatte utilizzando un rotore Singer ad alta densità arraying sistema robotico. In alternativa, manuale pinning o una base liquida ad alta densità di robot arraying possono essere utilizzati.
   
   Acronimi: YPD, estratto-peptone-destrosio lievito, SD, di abbandono di sintesi; LRK, Lue / Arg / Lys abbandono dei media; LHRK, Lue / suo / Arg / Lys abbandono dei media
   
   Preparazione
3. Microscopia:
   1. Scegli il desiderato mutante (s) che esprime Acp1-GFP direttamente dal piatto.
   2. Crescere le cellule a 30 ° C in YPD o SD - I suoi mezzi di accedere alla fase precoce.
   3. Visualizzare al microscopio confocale utilizzando il filterset GFP. Un esempio di risultato atteso è illustrato nella Figura 1.

SGA media:

I media di crescita (YPD) e dei media la selezione (SD) utilizzato in questo protocollo è utilizzato di routine nella biologia molecolare del lievito. Si prega di fare riferimento al metodo di lievito (Amberg et al., 2005) per le descrizioni dettagliate.

LRK, LHRK media (per 400 ml totali)

Aggiungi al fine	Quantità
Lievito base azotata con solfato di ammonio	2,7 g
Aminoacidomescolare	0,8 g
Agar	8 g
dH 2 O	360 ml
Autoclave
20% di destrosio	40 ml
Raffreddare a 65 ˚ C
100 mg / ml canavanina	0,2 ml
100 mg / ml thialysine	0,2 ml
Mescolare, versare 50 ml per piastra

LRK, LHRK + G418 media (per 400 ml totali)

Aggiungi al fine	Quantità
Lievito base azotata senza solfato di ammonio	0,7 g
Acido mix di aminoacidi	0,8 g
Glutammato monosodico	0,4
Agar	8 g
dH 2 O	360 ml
Autoclave
20% di destrosio	40 ml
Raffreddare a 65 ˚ C
100 mg / ml canavanina	0,2 ml
100 mg / ml thialysine	0,2 ml
200 mg / ml di G418	0,4 ml
Mescolare, versare 50 ml per piastra

Arricchito sporulazione media (per 400 ml totali)

Aggiungi al fine	Quantità
Acetato di potassio	4 g
Estratto di lievito	0,4 g
Destrosio	0,2 g
Sporulazione mix di aminoacidi	0,04 g
Agar	8 g
dH 2 O	360 ml
Autoclave
Raffreddare a 65 ˚ C
200 mg / ml di G418	0,4 ml
Mescolare, versare 50 ml per piastra

Discussion

Questo metodo può aiutare in modo efficiente incorporare un marcatore mitocondriale, Acp1-GFP in vari contesti mutante. Essa si basa sull'utilizzo di un sistema robotico, e può essere facilmente adottata per l'utilizzo con qualsiasi sistema robotico. Questa procedura può essere utilizzata anche per l'integrazione di altri tipi di marcatori. Ad esempio, per visualizzare ER, si usano abitualmente il marcatore Erg11-GFP. Nelle nostre immagini rappresentative, un mutante e un tipo selvaggio con la Acp1 GFP-creatore sono stati visualiz ed al microscopio confocale per studiare la morfologia dei mitocondri. Il mutante ha mostrato sconvolto fenotipo mitocondriale, ed è quindi un buon candidato per ulteriori indagini.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SGA media			The growth media (YPD) and synthetic dropout media (SD) including LRK and LHRK, and enriched sporulation media used in this protocol is routinely used in yeast molecular biology. Please refer to Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) for detailed descriptions.