Summary
Lente de desenvolvimento envolve interações com outros tecidos. Mutantes olho várias zebrafish são caracterizados por um tamanho de lente anormalmente pequena. Aqui demonstramos um experimento de transplante de lente para determinar se este fenótipo é devido a causas intrínsecas ou interações com defeito com os tecidos que circundam a lente.
Abstract
A lente tem um papel importante no desenvolvimento do cálice óptico [1,2]. Usando o zebrafish como um organismo modelo, questões relativas ao desenvolvimento da lente pode ser tratada. O peixe-zebra é útil para estudos genéticos, devido a várias características vantajosas, incluindo pequeno tamanho, alta fecundidade, ciclo de vida curto, e facilidade de cuidado. Desenvolvimento lente ocorre rapidamente em zebrafish. Em 72 hpf, a lente zebrafish é funcionalmente maduros [3]. Abundantes recursos genéticos e moleculares estão disponíveis para apoiar a investigação no zebrafish. Além disso, a semelhança do olho zebrafish aos de outros vertebrados fornece base para a sua utilização como excelente modelo animal de defeitos humanos [4-7]. Mutantes zebrafish várias lentes apresentam anormalidades, incluindo altos níveis de morte celular, que em alguns casos, leva a uma degeneração completa de tecidos lente [8].
Para determinar se as anormalidades lente são devido a causas intrínsecas ou com defeito interações com os tecidos circundantes, o transplante de uma lente de mutantes em um olho do tipo selvagem é executada. Agulhas utilizando-fogo de metal polido, lentes mutante ou tipo selvagem são cuidadosamente dissecados do animal doador, e transferido para o host. Para distinguir os tecidos do tipo selvagem e mutante, uma linha de transgênico é usado como o doador. Esta linha expressa ligada à membrana GFP em todos os tecidos, incluindo a lente. Esta técnica de transplante é uma ferramenta essencial nos estudos de mutantes lente zebrafish.
Protocol
Parte 1: Preparando os embriões
Neste protocolo, vamos usar o jj símbolo xy para denotar um mutante lente hipotética zebrafish.
- Cepas de peixe-zebra são mantidos em condições de instalação padrão peixes em 28,5 C em um ciclo light/10h 14h escuro.
- À noite, os machos e fêmeas lugar da cepa zebrafish jj xy: AB / TU; tg (mGFP) em um tanque com um divisor de separá-los uns dos outros. A progênie desta cruz vai expressar o transgene GFP em todos os tecidos, e serão utilizados como doadores. Em paralelo, use o mesmo procedimento para configurar o cruzamento entre não-transgênicas do tipo selvagem animais. Dependendo da finalidade desse experimento, pode-se cruzar animais de tipo selvagem no locus jj xy como doadores ou hosts.
- Dentro de uma hora após a luz acende na parte da manhã, retire os divisores para permitir que os peixes para acasalar.
- Depois de 15-30 minutos coletar embriões em 100 x 15 milímetros pratos Petri, limpá-los e alterar o meio (água de ovo).
- Manter os embriões em uma incubadora até 28,5 C tempo desejado.
- Quando estiver pronto para transplante, remover o córion manualmente com duas pinças afiadas, e incubar os embriões em EDTA 0,2% em cálcio livre ZFR por 30 minutos.
Parte 2: Preparação de agulhas de dissecção
- O procedimento de transplante requer dois tipos de agulhas: uma aguçada, que é usada para cortar tecidos em volta da lente, remova o córion e embriões liberação de agarose, e uma agulha sem corte utilizado para mover a lente de doadores e inseri-lo no host. Aqui vamos mostrar-lhe como fazer estas agulhas.
- Em primeiro lugar, a ponta de uma pipeta Pasteur deve ser cortado com uma faca de diamante. Em seguida, insira um capilar de vidro na ponta da pipeta Pasteur, para que cerca de metade do seu comprimento é dentro dela. Isto tornará mais fácil para imobilizar o fio de tungstênio pelo derretimento-lo no vidro na próxima etapa.
- Em seguida, insira um fio de tungstênio fino na extremidade aberta do capilar. Derreter o vidro sobre o fio com um bico de Bunsen. Utilizando uma pinça, segure firme a fim de vidro com o fio de metal, enquanto torcendo a outra extremidade da agulha com a mão. O vidro amolecido deve espiral em torno do metal agarrando-o no lugar.
- Se você está fazendo uma ponta da agulha sem corte, então este é o fim do procedimento. Para criar uma agulha afiada, segure o fio de tungstênio sobre um bico de Bunsen para 1-1,5 minutos, queimando o metal para uma ponta muito fina é criado. Verificar a qualidade da ponta de microscropy.It é uma boa idéia para esterilizar ambas as agulhas na chama por alguns segundos, imediatamente antes do transplante.
Parte 3: Preparação dos reagentes
- Sem cálcio Zebrafish Ringer (ZFR) Solutions (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 5 mM HEPES, pH 7.2)
- 0,2% EDTA em cálcio livre Zebrafish Ringer Solutions (pH 7,2)
- Agarose 1,2% (baixo ponto de fusão) em cálcio livre ZFR
- Agarose 0,2% (baixo ponto de fusão) em cálcio livre ZFR
- Médio de embriões (pH 7,0, por litro, contém: 10 ml da solução Hanks # 1, 1 ml da solução Hanks # 2, 10 ml da solução Hanks # 4, 10 ml da solução Hanks # 5, 0,35 g de bicarbonato de sódio, 300 uL de 2M de HCl, a penicilina-estreptomicina 500 mil U) Assim como em O Livro Zebrafish (University of Oregon Press, 2000).
- Fio de tungstênio, ouro diâmetro, banhado a 0,1 milímetros, Alfa Aesar
- Tubo capilar, 1,0 milímetros de diâmetro, instrumentos de precisão Mundial
Parte 4: Processo de Transplante
- Em um tubo de centrífuga de plástico, prepare 1,2% baixo ponto de fusão de agarose em cálcio livre ZFR pré-aquecido a 40 C em banho-maria.
- Na fase desejada (30 hpf, por exemplo), pegar os embriões em uma pipeta Pasteur, expulsá-los lentamente para dentro do tubo de centrífuga, e, lentamente, expulsá-los para dentro do tubo de centrífuga e incubar por aproximadamente 5 segundos. Os doadores e os anfitriões devem ser incubados separadamente.
- Com uma pipeta, tomar-se os embriões em agarose 1,2% a partir do tubo de centrifugação e organizá-los em duas fileiras paralelas de 100 milímetros de poliestireno prato Petri, mantendo hosts e doadores distintos. Pipetando-los devagar e com cuidado, a maioria dos embriões vai se deitar de lado na agarose. Você terá que reorientar aqueles que não estão nesta posição utilizando a agulha com modo que o olho está voltado para cima antes do agarose solidifica.
- Aguarde o agarose 1,2% para solidificar e depois cobri-la com 0,2% de fusão solução ponto baixo agarose.
- Utilizando a agulha afiada, remova qualquer agarose ao redor dos olhos, e com muito cuidado cortou a lente para fora a partir do host e embriões de doadores usando pequenos acidentes vasculares cerebrais. Certifique-se de cortar apenas perto o suficiente para a lente para não rasgá-lo, mas também para que você não remover o tecido muito do resto do olho host.
- Uma vez livre, as lentes vão flutuar no meio. Utilizando a agulha sem corte, empurre cuidadosamente o doadorlente para um pouco acima do local onde a lente de acolhimento seria normalmente, e, em seguida, empurre-o para dentro do olho com a agulha sem corte. A lente de acolhimento podem ser descartados.
- Deixe embriões de doadores e de acolhimento na agarose 1,2% por 30-60 minutos, e depois libertá-los da agarose utilizando a agulha afiada, e transferi-los em uma placa de 24 poços, com meio embrião. Cada embrião deve ocupar um bem separado. Certifique-se de rotular os poços corretamente de modo que fica claro qual host que corresponde ao doador.
- Incubar a 28,5 C. O doador-derivado lente pode ser distinguida da lente hospedar no lado não operados do mesmo animal com base em GFP fluorescência. Seções também podem ser feitos para medir o tamanho da lente e para determinar se diferencia corretamente.
Fig. 1 imagem baixa ampliação de uma agulha afiada usada para lentes transplante. Um capilar de vidro (B) é inserido na pipeta Pasteur (A), e um fino fio de tungstênio (C) é inserido na extremidade aberta do capilar. O vidro sobre o fio é amenizada com um bico de Bunsen. Utilizando uma pinça, segure firme a fim de vidro com o fio de metal, enquanto torcendo a outra extremidade da pipeta Pasteur com a mão. O vidro amolecido deve espiral em torno do metal, agarrando-o no lugar.
Fig. 2 As pontas dos dois tipos de agulhas usadas para a lente transplante.
Fig. 3 embriões foram submetidos a transplante de lente 30hpf. Mostrados são um embrião doador (A, B), um olho com lente de acolhimento em transplantados (C, D), eo lado controle do embrião hospedeiro (E, F). Cada olho é mostrada em ambas luz transmitida e iluminação UV conforme indicado. Fotografias foram tiradas em 48 hpf. O Q01 [9] linhagem transgênica foi utilizada neste experimento.
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Discussion
Várias etapas requerem atenção especial durante transplantes lente.
- Afiadas agulhas: É melhor preparar várias agulhas antes de realizar o transplante de lente, e na ponta das agulhas deve ser o mais fino possível. A agulha mais grossa vai rasgar mais tecido devido ao seu maior diâmetro, causando uma falha no olho para curar.
- Organizando os embriões: Direita antes do transplante você deve posicionar os embriões para que eles estão mentindo em seus lados. Ao posicionar, a agarose 1,2% pode endurecer muito rapidamente. Para retardar o endurecimento do agarose, a placa de Petri podem ser pré-aquecido, deixando-a flutuar no banho-maria a 40 ° C.
- Antes de inserir a lente para o olho doador host, tente remover agarose, tanto em torno da cabeça anfitrião possível. É mais fácil inserir a lente doador dessa forma.
- Logo após a lente transplante de embriões deve ser deixado embutidos na camada de agarose 1,2% coberto por uma camada de agarose 0,2%. Adicionando médio embrião com antibióticos irá promover a cicatrização de feridas em ambos os doadores e embriões host. Aguarde 30-60 minutos antes de liberar os embriões de agarose, e depois transferi-los para uma placa de 24 poços, com meio embrião.
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Acknowledgments
Este procedimento segue em grande medida a técnica de transplante desenvolvido para peixes caverna pelo laboratório de Bill Jeffrey.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1mm diameter tungsten wire | A Johnson Matthey | 45086 | |
| Agarose(low melting point) | Sigma-Aldrich | 39346 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW 100-4 | |
| Forceps | Dumont | 11252-30 | |
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Pipette pump | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Petri Dish | Cardinal Health | D1906 | |
| Penicillin-streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 |
References
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