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Biology

Dendra2 Photoswitching a través de la ventana de imágenes mamarias

Published: June 5, 2009 doi: 10.3791/1278
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,2, 1,2,3
1Department of Anatomy and Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine - Yeshiva University, 2Gruss Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine - Yeshiva University, 3Hubrecht Institute-KNAW and University Medical Center Utrecht

Summary

Photoswitching intravital y el seguimiento de Dendra2 marcado con las células tumorales a través de la ventana de imagen mamaria es una técnica que nos permite la imagen del comportamiento metastático de las células tumorales en los microambientes tumor elegido por un plazo de días.

Abstract

En la última década, la microscopía intravital de los tumores de mama en ratones y ratas en una sola célula de resolución

Protocol

1. Generación de tumores fluorescente mediante la inyección de células tumorales en la almohadilla de grasa mamaria:

  1. Cultivar una línea celular que expresa Dendra2 proteínas (como un marcador citoplasmático) a 40 - 80% de confluencia.
  2. Enjuague los platos por lo menos 3 veces con PBS w / o Ca 2 + o Mg 2 +.
  3. Añadir 3 ml de tripsina por plato de 10 cm y se incuba a 37 ° C hasta que la mayoría de las células de separar y volver a golpear el plato sobre una superficie plana para que temblar.
  4. Enjuague todas las células de la placa, y el uso de un raspador (goma de policía) para recoger la matriz también. Agregar los 5 ml de PBS. Tomar una alícuota de contar durante el centrifugado.
  5. Centrifugar a 800 g por 5 min.
  6. Aspirar y volver a suspender en PBS a una concentración de 5 - 10 x 10 6 / ml. Almacenar en el congelador hasta inyectado (inyección a los 30 minutos).
  7. Coloque una jaula que contiene 4-5 semanas de edad ratones inmunodeficientes (SCID, por ejemplo) dentro de una campana estéril.
  8. Rocíe el área alrededor de la cuarta (abdominal) pezón con etanol al 70%.
  9. Inyectar 0,1 ml en la almohadilla de grasa mamaria. Si un asistente se puede encontrar, una persona puede ocupar el ratón en su lugar mientras se inserta otra aguja dentro de la almohadilla de grasa mamaria. Si se inyecta usted mismo, ponga el ratón bajo anestesia ligera con isoflurano.
  10. Una vez que el tumor ha crecido a 5.7 mm, la ventana de imagen Mamaria (MIW) debe ser insertado.
    Nota: Como alternativa, para algunas aplicaciones, la MIW pueden ser insertados en la parte superior de la almohadilla de grasa mamaria sana y las células se pueden inyectar después. Este enfoque permite que imágenes de las células transfectadas transitoriamente en un entorno fisiológico.

2. Manual de fabricación de la ventana de imágenes mamarias (MIW):

  1. MIWs (Figura 1) son de plástico tejido de grado para garantizar la biocompatibilidad. Para la construcción manual, usamos cinco o platos de 10 cm.
  2. Poner los guantes de látex en.
  3. Calentar un plato de cultivo de tejidos y creando una superficie curva, empujando un objeto redondo, duro contra el plato caliente (usamos un poco de 1 pulgada dremmel para esto).
  4. Cortar el centro del plato con una hoja de afeitar caliente.
  5. Use una pequeña, en forma de cono poco dremmel para hacer un agujero en el centro de la cúpula en forma de base de plástico (6-7mm de diámetro).
  6. Hacer que los bordes de la base de plástico completamente lisa por el lijado con la dremmel y continuar con su presentación.
  7. Archivo de la parte superior de la base de plástico que hace una superficie plana para el cubreobjetos. El diámetro de la presentada, superficie plana debe ser de 9-10mm.
  8. Pegue la circular de 8 mm cubreobjetos (número 1) en la superficie plana con el pegamento (adhesivo de cianoacrilato).
  9. Espere a que el pegamento se seque (15 minutos).
  10. Use una aguja 26G con calefacción para hacer ocho agujeros de perforación de sutura desde el exterior (donde el vidrio es) en el interior de la base. Los agujeros deben ser distribuidas uniformemente alrededor del cubreobjetos, 0,5-1m m de distancia desde el borde del cubreobjetos.
  11. Ampliar los orificios con una aguja de sutura 5-0.
  12. Perforar agujeros en la base de plástico hará que la superficie interna irregular. Con papel de lija, hacen de esta superficie totalmente lisa.
  13. Cambiar de guantes y un cepillo de pequeñas partículas de plástico de la MIW con un pequeño cepillo.
  14. Lave el MIW con agua destilada.
  15. Lave el MIW con etanol al 70%. Usar un Q-tip para limpiar el cristal por lo que es completamente transparente. Si hay manchas de niebla presente en el vapor de pegamento, use cuidadosamente la acetona con un Q-tip.
  16. Esterilizar el MIW por exposición a rayos UV durante 3 horas a cada lado.

Semi-manual de fabricación de la ventana de imágenes mamarias (MIW):

Para fabricar la base de plástico, que actualmente estamos utilizando silicona moldes de goma creados con hechos a mano MIWs. El molde se compone de dos partes de caucho de silicona que hacer una réplica exacta de la parte delantera y trasera de la original, cuando se llena con resina de poliéster y de inmediato se unieron. La resina de poliéster líquido se mezclan las 9:10 y resulta en una estructura dura cuando está totalmente curado en 48 horas. El plástico es con protección UV y de archivo, sin descomponerse o ser amarillo con el tiempo.
Después de la base se cura, 2.8-2.16 pasos se llevan a cabo la misma manera que para MIWs manualmente a medida.

3. La inserción de la MIW:

  1. El área alrededor del pezón 4 º debería haber un pequeño (diámetro de 5-7 mm), tumor de varios días / semanas después de la inyección de células tumorales en función del tipo de células (fig. 1B). ¿Cuánto tiempo ha pasado después de la inyección de células que expresan proteínas Dendra2 photoswitchable u otras proteínas fluorescentes depende de la línea celular utilizada. El tumor no se deberá presentar una apariencia necrótica, y debe tener una piel intacta con el pelo en la parte superior del tumor. Los ratones con tumores necróticos debe ser sacrificado.
  2. Preparar el espacio estéril para la cirugía, establecer un trozo de tela estéril dentro de una campana estéril. Ponga un pedazo de estériles gauze en el medio, y sentar las MIWs pocos instrumentos estériles alrededor de él: que utilizamos pequeñas tijeras estándar, tijeras de primavera, pinzas microdissecting, pinzas microdissecting, porta-agujas. Mantener estériles Q-tips, una botella de etanol al 70% y guantes estériles en la esquina de la campana.
  3. El ratón es anestesiado en la campana estéril mediante inyección IP de 2,5% avertina (20 l / g) en HBSS, o bien 10 mg / kg de ketamina + 10 mg / g xilazina (en contacto con su Instituto de Atención de Animales para la aprobación y hacer el pedido).
    Nota: La solución Avertin debe estar preparado dos veces por semana, usando un filtro esterilizado 0,22 micras filtro y se almacena hasta 500 alícuotas a 4 ° C (en la oscuridad).
  4. Eliminar el vello por el afeitado de la zona por encima del tumor usando una máquina de afeitar de pequeños animales.
  5. Retire el resto del pelo con el pelo Nair crema del retiro (disponible en cualquier farmacia). Limpie la piel con etanol por inmersión en Q-tips.
  6. La transferencia de los animales en la gasa estéril y aplique una pomada oftálmica de los ojos para evitar que se sequen y las infecciones.
  7. Esterilizar la piel con Betadine y limpia con etanol al 70%.
  8. Transferencia del animal sobre un paño quirúrgico estéril dentro de la campana estéril.
  9. Tire de la piel inmediatamente medial al pezón con unas pinzas de corte y la incisión de 2 mm ~ en la piel.
  10. Separar la almohadilla de grasa mamaria subyacente de la piel con unas tijeras y pinzas de disección. La piel y para hueco durante esta etapa de separación a un tamaño que tendrá en cuenta la inserción de la MIW.
  11. Si por accidente de un buque se ve afectado durante sugery, utilice un recipiente estéril Q-tips para eliminar la sangre que se produce / para detener la hemorragia sea excesiva.
  12. Inserte el MIW de tal manera que no es la piel en la parte superior de la base de MIW y sutura en su sitio que no se usen hilo absorbible y revertir el corte de la aguja.
  13. El uso de tejido adhesivo de cianoacrilato o para rellenar los agujeros de sutura y asegurar el MIW a la piel.
  14. Añadir TMP-SMX combinación de antibióticos: (sulfametoxazol 0,6 mg / ml, Trimetoprim 0,12 mg / ml) en la botella de agua para la jaula de 3 días antes y después de la cirugía.
  15. El animal se mantiene bajo anestesia para 1-4h después de la inyección IP avertina. Dado que la cirugía generalmente lleva alrededor de 45 minutos, es importante para ayudar a los animales se recuperan después:
  16. Colocar una compresa caliente a mano (37 ° C) (disponible en farmacias) en la parte inferior de la jaula y cúbrala con una gasa.
  17. Mantener al animal en la parte superior de la almohadilla hasta que se convierte en su estómago y comienza a caminar.
  18. Si el animal está inconsciente por más de 3 horas, inyecte 0,3 ml de HBSS por vía intraperitoneal para la rehidratación.
  19. El animal se le permite recuperarse en los próximos 3-4 días antes de la sesión de imágenes primero se lleva a cabo.

4. Estructura de la caja de imagen

El cuadro de imagen asegura que el MIW está sentado plano, justo por encima del objetivo del microscopio. También facilita el control de temperatura y flujo de aire constante a través de la anestesia de isoflurano. La caja está fabricada en plexiglás y se pegan entre sí mediante soldadura de plástico. Sean aptas para la platina del microscopio específico y por lo tanto la forma de su parte inferior varía en función del microscopio usado (Figura 2 muestra el esquema de la caja instalados en fase microscopio Leica SP5).
Dimensiones de la caja en centímetros son l = 11,4 cm, w = 7,6 cm, h = 4,4 cm (Figura 2). La parte inferior del cuadro se compone de una placa hueca, 12.7x8.4 cm de tamaño, que cabe dentro de la platina del microscopio Leica SP5, y dos correderas "puertas" de 5,7 x 5,7 cm_each, que forman una abertura circular (d = 2,22 cm ) cuando está cerrado. El MIW se ajusta a esta apertura. La pieza frontal contiene el orificio de entrada para la aplicación de anestesia, mientras que una de las piezas laterales contiene un orificio de salida que conduce al vacío.
Tenga en cuenta que el condensador y el soporte de diapositivas deben ser removidos antes de la colocación de cuadro de imagen.

5. Caja de imagen Uso

  1. Colocar el animal bajo anestesia con isoflurano y aplicar ungüento oftálmico para los ojos.
  2. Conecte el tubo de escape isoflurano de la máquina de anestesia al frente de la caja de imagen, en la parte exterior del orificio de entrada (Figura 2B).
  3. Conecte un segundo tubo en el orificio de salida de la caja de imagen. Este tubo debe ser conectado al filtro de gas y luego al vacío.
  4. Abra la tapa de la caja y abrir las puertas de la caja y colocar el animal, MIW lado frente a la parte inferior, y el deslizamiento de las puertas en la caja.
  5. Mantenga la caja y ajustar las puertas abajo para que la base MIW se lleva a cabo y se inmovilizan entre ellos. La base de MIW debe estar en el mismo nivel que las puertas de imágenes caja, mientras que el cubreobjetos MIW debe ser sólo unos pocos milímetros por debajo de este nivel. Asegúrese de que el posicionamiento de la MIW entre la parte inferior las puertas corredizas se asegura de que el cubre (parte de vidrio de la MIW) quede plano, paralelo a la puerta inferior de la caja. Esto asegurará un enfoque apropiado.
  6. Baje el objetivo de microscopio, para dejar espacio para la colocación de la caja enparte superior de la platina del microscopio.
  7. Coloque la caja sobre la platina del microscopio, y ajustar el escenario para que el cubreobjetos MIW está por encima del objetivo.
  8. Enfoque el objetivo y comenzar a imágenes.
  9. Durante el uso de isoflurano, el animal debe ser supervisada por la inspección visual de la frecuencia respiratoria. Esto se puede hacer visualmente, o mediante el control de la frecuencia de los artefactos de respiración que aparecen durante la exploración de recogida (que puede interferir con la adquisición de datos). El sistema MouseOx la oximetría de pulso (Starr Ciencias de la Vida Corp) ha sido utilizado con éxito. De esta manera los datos pueden ser recogidos de manera continua sin encender las luces en la habitación para comprobar sobre el animal.
    Nota: Después de cada sesión de imágenes, recuperación de animales debe ser facilitado por envolver una almohadilla de calefacción pequeña gasa o Kimwipes y ponerlo en el animal en la jaula.
    Nota: Si un objetivo de inmersión se utiliza para la imagen a través de la MIW, el medio de la inmersión (glicerina, agua, aceite) se debe limpiar fuera de la ventana de imagen. El MIW deben ser inspeccionados para detectar posibles grietas u otros daños que pudiera haber ocurrido durante la exploración. Esto es crítico para la recogida de datos durante las sesiones de formación de imágenes múltiples.

6. Photoswitching y la imagen de Dendra2 células marcadas con

El procedimiento se describe en el microscopio confocal Leica SP5, la potencia del láser en el plano focal, objetivos y opciones disponibles puede variar cuando se utilizan otros microscopios confocal o imágenes multifotónica establecido, y por lo tanto el protocolo descrito a continuación deben ser utilizadas como una guía para optimizar la prueba en su microscopio.

  1. Al observar el tumor a través del ocular (10x) con el filtro verde fluorescente, localizar los principales vasos sanguíneos que están visiblemente fluye y tumbado en el mismo plano focal.
  2. La posición de uno de los buques en el centro del campo y pasar a la detección de PMT.
  3. Establezcan sistemas de recogida de imágenes secuenciales para dos canales. Uno de los canales utiliza 488 nm láser de línea (10% de potencia), y recoge la dispersión de la matriz extracelular (480-495nm) y emisiones de la forma verde de Dendra2 (505-540nm). El segundo canal utiliza la línea del láser 543nm (90% de potencia) y recoge las emisiones de la forma roja de Dendra2 (555-600nm). Recoge imágenes en 3D photoswitching pre-.
  4. Utilice la opción ROI escanear a PHOTOSWITCH una población elegida de las células con la línea de láser de 405 nm (30% de potencia, las exploraciones 20-40). Recoger emisiones de la forma roja de la proteína para controlar el cambio.
  5. Utilizando la misma rutina secuencial como en 6.3, recoger después de cambiar las imágenes en 3D.
  6. Si photoswitching más de una región en el tumor, se recomienda para tomar fotografías a través de los oculares con una cámara digital, en los canales verde y rojo (Figura 3A, B). Esto le ayudará en la orientación durante las sesiones de formación de imágenes posteriores.
    Nota: Además, los vasos sanguíneos puede ser temporalmente etiquetados con cola-vena de inyección de dextrano fluorescentes (Cascada Azul o Alexa Fluor 647, ambos 10kDa). Unas pocas horas después de la inyección, dextranos dejará los vasos sanguíneos y permanentemente la etiqueta de los macrófagos.

Los resultados representativos:

La figura 3C muestra una región rectangular photoswitched (rojo) orientados ortogonalmente con respecto a los vasos sanguíneos (no fluorescencia). No photoswitched células son de color verde, mientras que la dispersión de la matriz extracelular es de color púrpura. La imagen es una proyección de intensidad máxima de cuatro imágenes a lo largo del eje Z (20-50 m de profundidad).

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Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por los EE.UU. Departamento de Defensa (BC075554 a BG y BC061403 a DK), EE.UU. Institutos Nacionales de Salud (U54GM064346 a JvR; CA100324 a JC, JES y JW, CA77522 a JES, U54CA126511 a JC y BG). Damos las gracias a D. Entenberg para ayudar con el microscopio, M. Rottenkolber para ayudar en la fabricación de la caja de imagen y J. Pollard (Albert Einstein College of Medicine) para el anticuerpo F4/80.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS w/o Ca, Mg GIBCO, by Life Technologies 14190-144
Trypsin GIBCO, by Life Technologies 25300
HBSS GIBCO, by Life Technologies 14025
DMEM media (MDA-MB-231 cells) GIBCO, by Life Technologies 11965
Isoflurane(Aerrane) Baxter Internationl Inc. # NDC 10019-773-40
SCID mouse National Cancer Institute N/A
Culture dishes BD Biosciences 353003 Custom Order
Circular coverslip 8 mm Scientific, Inc. 8CIR-1-FIS

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References

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Gligorijevic, B., Kedrin, D., Segall, J. E., Condeelis, J., van Rheenen, J. Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window. J. Vis. Exp. (28), e1278, doi:10.3791/1278 (2009).

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