Batch immunfärgning för storskaliga Protein Detection i hela Monkey Brain
Summary
Storskalig immunodetection av målproteiner hela primat hjärnan är möjligt genom att anställa ny vävnad inbäddning och snittning metoder i kombination med användning av kreativa apparater för parti färgning av flera fritt flytande sektioner vid en viss tidpunkt.
Abstract
Immunohistokemi (IHC) är en av de mest använda Laboratoriemetoder för detektion av målproteiner<em> På plats</em>. Frågor om uttrycket mönster av ett målprotein över hela hjärnan är relativt lätt att svara när du använder IHC i små hjärnor, till exempel av gnagare. Men svara på samma frågor i stora och invecklad hjärnor, till exempel av primater presenteras ett antal utmaningar. Här presenterar vi ett systematiskt tillvägagångssätt för immunodetection av målproteiner i en vuxen apa hjärna. Detta synsätt bygger på vävnad inbäddning och snittning metodik för neurovetenskap Associates (NSA) samt verktyg som utvecklats speciellt för parti-färgning av fritt svävande sektioner. Det resulterar i uniform färgning av ett antal sektioner som vid ett visst intervall, representerar hela hjärnan. Den resulterande färgade snitt kan utsättas för en mängd olika analysmetoder för att mäta protein nivåer, befolkningen i nervceller som uttrycker ett visst protein.
Protocol
Discussion
Det finns två viktiga steg i detta förfarande som gör storskalig detektion av proteiner i en hel apa hjärna möjligt. En är inbäddning och snittning protokoll, som fortfarande är patentskyddade kunskaper i NSA. Den andra är användningen av färgning rätter och korgar som HistoTools. Det senare möjliggör enkel och snabb hantering av många (~ 40) sektioner vid en viss tidpunkt. Det ger också medel för enhetligt behandla alla delar i hjärnan och ger en vetenskapligt sund histologisk behandling. Dessutom ger…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma till Frank Ervin, Roberta Palmour och personalen i beteendevetenskaper stiftelsen Laboratories i St Kitts, Västindien, för deras fortsatta stöd i vårt primat arbete. Detta arbete stöddes av ett stipendium från Fragile X Research Foundation i Kanada (FXRFC) för att SZ och – verksamhetsbidrag från den kanadensiska Institutes of Health Research (AC) och National Engineering och Research Council of Canada (MP).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| anti-FMRP monoclonal antibody | Chemicon | MAB2160 | Requires antigen retrieval in fixed tissue. | |
| anti-NeuN monoclonal antibody | Chemicon | MAB377 | N/A | |
| anti-Neurofilament H monoclonal antibody | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI32 | N/A | |
| Antigen Unmasking Solution | Vector Laboratories | H-3300 | N/A | |
| Normal horse serum | Invitrogen | 16050122 | 500 mL | |
| Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in horse | Vector Laboratories | BA-2000 | ||
| VECTASTAIN ABC Kit (Standard) | Vector Laboratories | PK-4000 | 1.5 mg | |
| Staining dish for floating sections | HistoTools | 10009 | 12 x 65 mm | |
| Staining transport basket | HistoTools | 10012 | large (fits 12 x 65 mm dish) |
|
| Triton X-100 | Fisher Scientific | P8514B | N/A | |
| DAB | Fisher Scientific | AC11209-0050 | N/A |
References
- Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. . Guide to the Care and Use of Experimental Animals. , (1993).
- Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet. 4, 335-340 (1993).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116, 201-211 (1992).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).
