Batch Immunfärbung für Large-Scale Protein-Nachweis im Whole Affenhirn
Summary
Großflächige Immundetektion der Zielproteine in der gesamten Primatengehirn wird durch den Einsatz von neuartigen Gewebe Einbettung und Schneiden Methoden mit dem Einsatz von kreativen Apparat für Batch-Färbung von mehreren frei schwebenden Abschnitte zu einem bestimmten Zeitpunkt in Kombination möglich.
Abstract
Immunhistochemie (IHC) ist eine der am häufigsten verwendeten Labor-Techniken für die Detektion von Target-Proteinen<em> In situ</em>. Fragen über die Expressionsmuster eines Zielproteins über das gesamte Gehirn sind relativ leicht zu beantworten, wenn Sie IHC in kleinen Gehirne, wie die von Nagetieren. Doch die gleichen Fragen in großen und gewundenen Gehirne, wie die der Primaten stellt eine Reihe von Herausforderungen. Hier präsentieren wir einen systematischen Ansatz für die Immundetektion der Zielproteine in einer erwachsenen Affen Gehirn. Dieser Ansatz stützt sich auf das Gewebe eingebettet und Schnitte Methodik der NeuroScience Associates (NSA) sowie Tools, die speziell für die Batch-Färbung der im Streubesitz befindlichen Abschnitten entwickelt. Es führt zu einer gleichmäßigen Färbung von einer Reihe von Abschnitten, die in einem bestimmten Intervall, stellt das gesamte Gehirn. Die daraus resultierenden gefärbten Schnitten kann auf eine Vielzahl von analytischen Verfahren unterzogen werden, um Protein-Spiegel, die Bevölkerung von Neuronen, die ein bestimmtes Protein zu messen.
Protocol
Discussion
Es gibt zwei kritische Schritte in diesem Verfahren, dass groß angelegte Nachweis von Proteinen in einer ganzen Affenhirn möglich zu machen. Eine davon ist die Einbettung und Schneiden-Protokoll, das die proprietäre Wissen NSA bleibt. Die andere ist die Verwendung der Färbung Schüsseln und Körbe von HistoTools zur Verfügung gestellt. Letzteres ermöglicht eine einfache und schnelle Handhabung von vielen (~ 40) Abschnitte zu einem bestimmten Zeitpunkt. Es bietet auch die Mittel für die gleichmäßige Behandlung a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns bei Frank Ervin, Roberta Palmour und das Personal des Behavioural Sciences Foundation Laboratories in St Kitts, West Indies, für ihre anhaltende Unterstützung unserer Primaten Arbeit befindet. Betriebskostenzuschüsse von der Canadian Institutes of Health Research (AC) und der National Engineering and Research Council of Canada (MP) – Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium Fragile X Research Foundation of Canada (FXRFC) auf SZ und unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| anti-FMRP monoclonal antibody | Chemicon | MAB2160 | Requires antigen retrieval in fixed tissue. | |
| anti-NeuN monoclonal antibody | Chemicon | MAB377 | N/A | |
| anti-Neurofilament H monoclonal antibody | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI32 | N/A | |
| Antigen Unmasking Solution | Vector Laboratories | H-3300 | N/A | |
| Normal horse serum | Invitrogen | 16050122 | 500 mL | |
| Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in horse | Vector Laboratories | BA-2000 | ||
| VECTASTAIN ABC Kit (Standard) | Vector Laboratories | PK-4000 | 1.5 mg | |
| Staining dish for floating sections | HistoTools | 10009 | 12 x 65 mm | |
| Staining transport basket | HistoTools | 10012 | large (fits 12 x 65 mm dish) |
|
| Triton X-100 | Fisher Scientific | P8514B | N/A | |
| DAB | Fisher Scientific | AC11209-0050 | N/A |
References
- Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. . Guide to the Care and Use of Experimental Animals. , (1993).
- Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet. 4, 335-340 (1993).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116, 201-211 (1992).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).
