Batch Immunokleuring Grootschalige eiwitdetectie in de Whole Brain Monkey
Summary
Grootschalige immunodetectie van target eiwitten in het hele primaat hersenen is mogelijk door het gebruik van nieuwe weefsel inbedden en snijden methoden gecombineerd met het gebruik van creatieve apparatuur voor batch kleuring van meerdere vrij zwevende delen op een gegeven moment.
Abstract
Immunohistochemie (IHC) is een van de meest gebruikte laboratoriumtechnieken voor de detectie van doeleiwitten<em> In situ</em>. Vragen over het expressiepatroon van een doelwit eiwit over de hele hersenen zijn relatief makkelijk te beantwoorden bij het gebruik van IHC in kleine hersenen, zoals die van knaagdieren. Echter, het beantwoorden van dezelfde vragen in grote en ingewikkelde hersenen, zoals die van primaten presenteert een aantal uitdagingen. Hier presenteren wij een systematische aanpak voor immunodetectie van target eiwitten in een volwassen aap brein. Deze aanpak is gebaseerd op het weefsel inbedding en snijden de methodologie van NeuroScience Associates (NSA) en hulpmiddelen die specifiek ontwikkeld voor de batch-kleuring van vrij zwevende delen. Het resulteert in uniform kleuring van een reeks van secties die op een bepaald interval, vertegenwoordigt het hele brein. De resulterende gekleurde coupes kunnen worden onderworpen aan een breed scala aan analytische procedures om de eiwit-niveaus, de bevolking van neuronen die een bepaald eiwit te meten.
Protocol
Discussion
Er zijn twee belangrijke stappen in deze procedure dat grootschalige detectie van eiwitten in een hele aap hersenen mogelijk te maken. Een daarvan is de inbedding en snijden protocol, dat blijft de eigen kennis van de NSA. De andere is het gebruik van vlekken gerechten en manden door HistoTools. Deze laatste zorgt voor eenvoudige en snelle afhandeling van een groot aantal (~ 40) delen op een bepaald tijdstip. Het biedt ook de middelen voor het behandelen van alle secties gelijkmatig over de hersenen en zorgt voor een we…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor Frank Ervin, Roberta Palmour en het personeel van de Gedragswetenschappen Stichting Laboratoria gevestigd in St. Kitts, West-Indië, voor hun blijvende steun van onze primaat werk. Dit werk werd ondersteund door een beurs van fragiele X Research Foundation of Canada (FXRFC) naar SZ en – exploitatiesubsidies van de Canadese Institutes of Health Research (AC) en de Nationale Engineering en Research Council of Canada (MP).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| anti-FMRP monoclonal antibody | Chemicon | MAB2160 | Requires antigen retrieval in fixed tissue. | |
| anti-NeuN monoclonal antibody | Chemicon | MAB377 | N/A | |
| anti-Neurofilament H monoclonal antibody | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI32 | N/A | |
| Antigen Unmasking Solution | Vector Laboratories | H-3300 | N/A | |
| Normal horse serum | Invitrogen | 16050122 | 500 mL | |
| Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in horse | Vector Laboratories | BA-2000 | ||
| VECTASTAIN ABC Kit (Standard) | Vector Laboratories | PK-4000 | 1.5 mg | |
| Staining dish for floating sections | HistoTools | 10009 | 12 x 65 mm | |
| Staining transport basket | HistoTools | 10012 | large (fits 12 x 65 mm dish) |
|
| Triton X-100 | Fisher Scientific | P8514B | N/A | |
| DAB | Fisher Scientific | AC11209-0050 | N/A |
References
- Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. . Guide to the Care and Use of Experimental Animals. , (1993).
- Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet. 4, 335-340 (1993).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116, 201-211 (1992).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).
