Immunostaining lotto per la grande rivelazione di proteine nel cervello della scimmia Whole
Summary
Su larga scala immunolocalizzazione di proteine bersaglio attraverso tutto il cervello dei primati è possibile utilizzando tessuti romanzo di inclusione e di sezionamento metodi combinati con l'impiego di attrezzature creativo per la colorazione in batch di più liberamente fluttuanti sezioni in un dato momento.
Abstract
Immunoistochimica (IHC) è una delle tecniche di laboratorio più utilizzato per la rilevazione di proteine bersaglio<em> In situ</em>. Le questioni concernenti il pattern di espressione di una proteina bersaglio attraverso tutto il cervello è relativamente facile rispondere quando si usa IHC nei cervelli piccoli, come quelli dei roditori. Tuttavia, rispondere alle stesse domande nel cervello di grandi dimensioni e contorto, come quelli dei primati presenta una serie di sfide. Qui vi presentiamo un approccio sistematico per immunolocalizzazione di proteine bersaglio in un cervello di scimmia adulta. Questo approccio si basa sul tessuto inclusione e il sezionamento metodologia di Neuroscienze Associates (NSA), oltre a strumenti sviluppati appositamente per batch-colorazione di free-floating sezioni. Essa si traduce in colorazione uniforme di una serie di sezioni che, ad un intervallo particolare, rappresenta l'intero cervello. Le sezioni colorate risultante può essere sottoposto a una vasta gamma di procedure analitiche per misurare i livelli di proteina, la popolazione di neuroni che esprimono una certa proteina.
Protocol
Discussion
Ci sono due passi fondamentali in questa procedura che rendono grande il rilevamento di proteine in un cervello della scimmia intero possibile. Uno è il protocollo di inclusione e di sezionamento, che rimane la conoscenza di proprietà della NSA. L'altra è l'uso di piatti colorazione e cesti forniti da HistoTools. Quest'ultimo consente di utilizzo semplice e veloce di molti (~ 40) sezioni in un dato momento. Inoltre fornisce i mezzi per trattare in modo uniforme tutte le sezioni in tutto il cervello …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a Frank Ervin, Roberta Palmour e il personale delle scienze comportamentali Laboratori Fondazione situato a St Kitts, nelle Indie Occidentali, per il supporto continuo del nostro lavoro primati. Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio Fragile X Research Foundation of Canada (FXRFC) a SZ e – sovvenzioni di funzionamento dal Canadian Institutes of Health Research (AC) e il National Engineering and Research Council del Canada (MP).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| anti-FMRP monoclonal antibody | Chemicon | MAB2160 | Requires antigen retrieval in fixed tissue. | |
| anti-NeuN monoclonal antibody | Chemicon | MAB377 | N/A | |
| anti-Neurofilament H monoclonal antibody | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI32 | N/A | |
| Antigen Unmasking Solution | Vector Laboratories | H-3300 | N/A | |
| Normal horse serum | Invitrogen | 16050122 | 500 mL | |
| Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in horse | Vector Laboratories | BA-2000 | ||
| VECTASTAIN ABC Kit (Standard) | Vector Laboratories | PK-4000 | 1.5 mg | |
| Staining dish for floating sections | HistoTools | 10009 | 12 x 65 mm | |
| Staining transport basket | HistoTools | 10012 | large (fits 12 x 65 mm dish) |
|
| Triton X-100 | Fisher Scientific | P8514B | N/A | |
| DAB | Fisher Scientific | AC11209-0050 | N/A |
References
- Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. . Guide to the Care and Use of Experimental Animals. , (1993).
- Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet. 4, 335-340 (1993).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116, 201-211 (1992).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).
