Summary

Immunostaining lotto per la grande rivelazione di proteine ​​nel cervello della scimmia Whole

Published: July 27, 2009
doi:

Summary

Su larga scala immunolocalizzazione di proteine ​​bersaglio attraverso tutto il cervello dei primati è possibile utilizzando tessuti romanzo di inclusione e di sezionamento metodi combinati con l'impiego di attrezzature creativo per la colorazione in batch di più liberamente fluttuanti sezioni in un dato momento.

Abstract

Immunoistochimica (IHC) è una delle tecniche di laboratorio più utilizzato per la rilevazione di proteine ​​bersaglio<em> In situ</em>. Le questioni concernenti il ​​pattern di espressione di una proteina bersaglio attraverso tutto il cervello è relativamente facile rispondere quando si usa IHC nei cervelli piccoli, come quelli dei roditori. Tuttavia, rispondere alle stesse domande nel cervello di grandi dimensioni e contorto, come quelli dei primati presenta una serie di sfide. Qui vi presentiamo un approccio sistematico per immunolocalizzazione di proteine ​​bersaglio in un cervello di scimmia adulta. Questo approccio si basa sul tessuto inclusione e il sezionamento metodologia di Neuroscienze Associates (NSA), oltre a strumenti sviluppati appositamente per batch-colorazione di free-floating sezioni. Essa si traduce in colorazione uniforme di una serie di sezioni che, ad un intervallo particolare, rappresenta l'intero cervello. Le sezioni colorate risultante può essere sottoposto a una vasta gamma di procedure analitiche per misurare i livelli di proteina, la popolazione di neuroni che esprimono una certa proteina.

Protocol

Immunohistochemisty è una delle tecniche più utilizzate per la caratterizzazione di espressione della proteina nel cervello di vari modelli sperimentali animali. E 'relativamente facile da condurre sistematiche procedure di immunoistochimica sul cervello di roditori e di altri comuni modelli sperimentali con le dimensioni del cervello simili. Tuttavia, non c'è lavoro pubblicato a nostra conoscenza, che fornisce un resoconto completo di come svolgere le procedure di immunolocalizzazione tale attraverso un inte…

Discussion

Ci sono due passi fondamentali in questa procedura che rendono grande il rilevamento di proteine ​​in un cervello della scimmia intero possibile. Uno è il protocollo di inclusione e di sezionamento, che rimane la conoscenza di proprietà della NSA. L'altra è l'uso di piatti colorazione e cesti forniti da HistoTools. Quest'ultimo consente di utilizzo semplice e veloce di molti (~ 40) sezioni in un dato momento. Inoltre fornisce i mezzi per trattare in modo uniforme tutte le sezioni in tutto il cervello …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Siamo grati a Frank Ervin, Roberta Palmour e il personale delle scienze comportamentali Laboratori Fondazione situato a St Kitts, nelle Indie Occidentali, per il supporto continuo del nostro lavoro primati. Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio Fragile X Research Foundation of Canada (FXRFC) a SZ e – sovvenzioni di funzionamento dal Canadian Institutes of Health Research (AC) e il National Engineering and Research Council del Canada (MP).

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
anti-FMRP monoclonal antibody   Chemicon MAB2160 Requires antigen retrieval in fixed tissue.
anti-NeuN monoclonal antibody   Chemicon MAB377 N/A
anti-Neurofilament H monoclonal antibody   Sternberger Monoclonals Inc. SMI32 N/A
Antigen Unmasking Solution   Vector Laboratories H-3300 N/A
Normal horse serum   Invitrogen 16050122 500 mL
Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in horse   Vector Laboratories BA-2000  
VECTASTAIN ABC Kit (Standard)   Vector Laboratories PK-4000 1.5 mg
Staining dish for floating sections   HistoTools 10009 12 x 65 mm
Staining transport basket   HistoTools 10012 large
(fits 12 x 65 mm dish)
Triton X-100   Fisher Scientific P8514B N/A
DAB   Fisher Scientific AC11209-0050 N/A

References

  1. Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. . Guide to the Care and Use of Experimental Animals. , (1993).
  2. Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet. 4, 335-340 (1993).
  3. Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116, 201-211 (1992).
  4. Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).

Play Video

Cite This Article
Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain. J. Vis. Exp. (29), e1286, doi:10.3791/1286 (2009).

View Video