Lote de inmunotinción para la detección de proteínas a gran escala en el cerebro del mono entero
Summary
A gran escala inmunodetección de las proteínas diana a través del cerebro de los primates todo es posible mediante el empleo de tejidos novedosos métodos de inclusión y corte en combinación con el uso de aparatos creativas para la tinción de lotes de varias secciones de flotación libre en un momento dado.
Abstract
Inmunohistoquímica (IHC) es una de las técnicas de laboratorio más utilizados para la detección de proteínas diana<em> In situ</em>. Las cuestiones relativas a los patrones de expresión de una proteína diana a través de todo el cerebro es relativamente fácil de responder cuando se utiliza IHC en los cerebros pequeños, como los de los roedores. Sin embargo, responder las mismas preguntas en un cerebro grande y complicado, como las de los primates presentan una serie de desafíos. Aquí se presenta un enfoque sistemático para la inmunodetección de las proteínas diana en el cerebro de un mono adulto. Este enfoque se basa en el tejido de inclusión y corte metodología de Asociados Neurociencias (NSA), así como herramientas desarrolladas específicamente para la tinción de lotes de libre flotación secciones. Es el resultado de la tinción uniforme de un conjunto de secciones que, en un intervalo particular, representa a todo el cerebro. Las secciones resultantes manchado puede ser sometido a una amplia variedad de procedimientos analíticos para medir los niveles de proteína, la población de neuronas que expresan una determinada proteína.
Protocol
Discussion
Hay dos pasos fundamentales en este procedimiento que hacen a gran escala de detección de proteínas en el cerebro de un mono completo posible. Uno de ellos es el protocolo de inclusión y corte, que sigue siendo el conocimiento de su propiedad de la NSA. El otro es el uso de platos de tinción y cestas proporcionada por HistoTools. Este último permite un manejo fácil y rápido de muchas (~ 40) secciones en un momento dado. También proporciona los medios para tratar de manera uniforme a todos los sectores a través …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos muy agradecidos a Frank Ervin, Palmour Roberta y el personal de Laboratorios de Ciencias de la Conducta fundación con sede en San Cristóbal, de las Indias Occidentales, por su continuo apoyo a nuestro trabajo de primates. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación X Frágil de Investigación de Canadá (FXRFC) a SZ y – subvenciones de funcionamiento de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (AC) y la Nacional de Ingeniería y de Investigación de Canadá (MP).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| anti-FMRP monoclonal antibody | Chemicon | MAB2160 | Requires antigen retrieval in fixed tissue. | |
| anti-NeuN monoclonal antibody | Chemicon | MAB377 | N/A | |
| anti-Neurofilament H monoclonal antibody | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI32 | N/A | |
| Antigen Unmasking Solution | Vector Laboratories | H-3300 | N/A | |
| Normal horse serum | Invitrogen | 16050122 | 500 mL | |
| Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in horse | Vector Laboratories | BA-2000 | ||
| VECTASTAIN ABC Kit (Standard) | Vector Laboratories | PK-4000 | 1.5 mg | |
| Staining dish for floating sections | HistoTools | 10009 | 12 x 65 mm | |
| Staining transport basket | HistoTools | 10012 | large (fits 12 x 65 mm dish) |
|
| Triton X-100 | Fisher Scientific | P8514B | N/A | |
| DAB | Fisher Scientific | AC11209-0050 | N/A |
References
- Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. . Guide to the Care and Use of Experimental Animals. , (1993).
- Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet. 4, 335-340 (1993).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116, 201-211 (1992).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).
