Biology

Maus Adrenal Chromaffin Zellisolation

Published: January 5, 2007 doi: 10.3791/129

Aaron Kolski-Andreaco¹, Haijiang Cai^2,3, D. Spencer Currle⁴, K. George Chandy¹, Robert H. Chow^2,3

¹Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine (UCI), ²Department of Physiology and Biophysics, University of Southern California, Keck School of Medicine, ³Zilkha Neurogenetic Institute, University of Southern California, Keck School of Medicine, ⁴Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI)

Summary

Nebennierenmarks chromaffinen Zellkultur-Systeme sind äußerst nützlich für die Untersuchung der Anregungs-Sekretion Kopplung in einem in vitro-Einstellung. Dieses Protokoll stellt das Verfahren verwendet werden, um den Nebennieren zu sezieren und dann isolieren medulläre Region durch Abstreifen der Nebennierenrinde. Die Verdauung der Medulla in einzelne chromaffinen Zellen wird dann demonstriert.

Abstract

Protocol

Abkürzungen:
ACC - Adrenal chromaffinen Zellen, E. Soln - Enzymlösung, E. DMEM - Enriched Dulbeccos Modified Eagle Medium

Vorbereitung
1. Add Papain auf die gewünschte Menge an E. Soln (40 Einheiten Papain / 1ml E. Soln.).
2. Aktivieren Papain mit Carbogen für etwa 15 Minuten auf dem Eis. Oxygenat Lockes Puffer auf Eis als auch.
Zergliederung
1. Verwenden Sie 8-10 Wochen Maus.
2. Vor Verdauung entfernen Sauerstoff Lockes Puffer und auf Eis stellen.
3. Siehe Video zum Präparieren Verfahren.
4. Einmal ausgeschnitten, mit Sauerstoff statt Drüsen in Lockes Puffer.
Vorbereitung von Gland
1. Entfernen Sie Fett aus Drüse.
2. Streifen Rinde ab Drüse.
Enzymatische Verdauung
1. Sterilfilter Sauerstoff Papain.
2. Machen Sie vier Pools des oxygenierten Papain auf eine Petrischale.
  1. 3 Pools sollte etwa 100uls werden.
  2. 1 des Pools sollte etwa 400uls werden.
3. Wash medullae durch Pools
  1. 1. bis der 3 100 ul-Pools.
  2. Dann durch die 400ul Pool
  3. Pippette 300ul E. Soln und Medulla Stücke aus 400ul Pool in Mikrozentrifugenröhrchen.
  4. Qrap Parafilm auf Mikrozentrifugenröhrchen und in 37 ° C Wasserbad für 20min.
  5. Denken Sie daran, mit Sauerstoff zu versorgen restlichen E. Soln mit Papain fortsetzen.
  6. Nach 20 Minuten Sterilfilter mehr E. Soln.
  7. Ersetzen Sie alte E. Soln Baden medullae mit neu gefiltert E. Soln.
Verreibungen
1. Absaugen und entsorgen E. Soln.
2. Wash medullae in 1ml E. DMEM.
3. Absaugen und entsorgen E. DMEM.
4. Add 300ul E. DMEM und verreiben 20X mit 1ml Spitze.
5. Cut 200 &mgr; l Spitze mit einer sterilen Rasierklinge.
6. Man reibt 5-10X mit Ausschnitt 200 &mgr; l Spitze.
7. Discard E. DMEM Baden medullae Stücke. Medium enthält Schutt.
8. Add 300uls frischen E. DMEM in Stücke medullae.
9. Man reibt mit 200 &mgr; l Spitze 20x
10. Pippette E. DMEM Mikrozentrifugenröhrchen withough medullae Stücke. Medium enthält freie ACC.
11. Add 300uls frischen E. DMEM in Stücke medullae.
12. Man reibt medullae mit einem 23,5 gauge Kanüle 20x.
13. Kombinieren E. DMEM aus beiden Verreibungen. Medullae Stücke sollten nicht anwesend sein und sollten nun eine federähnliche Aussehen.
Plating
1. Microfuge E. DMEM aus den letzten beiden Verreibung Schritte für 2,5 Minuten bei 3,7 g s.
2. Pellet in 50uls-200 E. DMEM, abhängig von nachfolgenden Experimenten.
3. Platte 10-30uls auf einem Deckglas.
4. Warten Sie 15 Minuten für die Zellen zu haften.
5. Add 750uls von E. DMEM.