Summary
胚胎大鼠脑组织总文化系统的一个协议描述。在聚集的多能祖细胞可以发展和分化成神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞。
Abstract
在体外系统概括了发展和祖细胞分化为成熟的神经元和神经胶质细胞在中枢神经系统（CNS）的，将提供一个强大的神经学家平台，调查轴突胶质细胞相互作用，性能和多能祖细胞的分化，少突胶质细胞的进展在细胞和分子水平的细胞系细胞。我们在这里介绍从胚胎大鼠forebrains，在无血清培养基可维持3-4周，并在我们的实验室用来作为模型来研究神经元的神经胶质细胞的相互作用和中枢神经系统的髓鞘的中枢神经系统的总的培养体系。本短片将展示如何隔离和成长E16大鼠脑组织中的中枢神经系统的总文化。此外，从相同的大脑解剖，经常游离神经文化高度浓缩，可随时获得和使用各种研究，对中枢神经系统神经元或用于与其他细胞共培养。
Protocol
前夹层的制备
手术工具：由高压灭菌消毒清扫剪刀和镊子
盖玻片清洁：
- 在1L草烧杯中33％的盐酸中浸泡至少24小时的所有盖玻片（直径为24孔板15毫米）
- 偶尔晃动的水10分钟，清除所有残留的盐酸洗
- 用微孔水冲洗
- 排水关闭
- 在95-98％的乙醇浸泡盖玻片
- 用干净的纸巾将盖玻片上平板和空气干燥的盖玻片
- 传输盖玻片一个玻璃烧杯中，盖上铝箔和高压灭菌器
注：盖玻片可以存储在这个阶段 - 个人盖玻片放入培养皿。涂层准备就绪
盖玻片涂层：
- 稀聚- D -赖氨酸100 x的PBS和过滤，消毒（0.22微米）的股票（PDL，10 mg / ml的0.5％的牛血清白蛋白的PBS存储，在-20 ° C等分）
- 1个客运专线解决方案（〜0.15毫升/厘米2），2小时在37℃的孵化器中的C大衣盖玻片
- 删除PDL的解决方案，完全洗3次，用无菌DDH 2 O和干燥的盖玻片
注：大衣足够的盖玻片/每个夹层板。 PDL涂层的盖玻片上可以存储在几个星期在4 ° C。
媒体和解决方案
夹层介质（DM）：使用无菌冰冷汉克的平衡盐溶液（W / O型的Ca 2 +，Mg 2 +的）（HBSS中，Invitrogen公司14175），辅以10毫米的HEPES（Invitrogen公司15630 ）。
总结文化传媒：DMEM/NBB27介质包含DMEM / Neurobasal（1:1卷：第一卷），2％B27，1 ×佐藤0.5毫米丙酮酸钠，0.75毫米GlutaMAX，60μg/mlN -乙酰半胱氨酸，5微克/毫升胰岛素，10NM D -生物素和1％青霉素/链霉素。为了使100毫升的总的培养液，混合50毫升的DMEM（W / O型丙酮酸/谷氨酰胺，Invitrogen公司的11960），50毫升Neurobasal培养基（Invitrogen公司211034），375μLGlutaMax（100 × 35050 Invitrogen公司），5.5毫克丙酮酸钠（Sigma公司P2256），2毫升B27（Invitrogen公司17504），6.3毫克N -乙酰半胱氨酸（Sigma公司A8199），1毫升佐藤股票（100 ×股票，见下文），25μLD -生物素的股票（股票，4000 × 40在PBS微米存储为分装于-20 ° C.六西格玛B4639），100μL胰岛素（1000 ×股票，在5毫克/毫升0.01N盐酸作为分装保存于-20 ° C，西格玛16634），和1 ml青霉素/链霉素（100 × 15140）股票，Invitrogen公司，过滤消毒和储存在4 ° C。
佐藤100 x股票的解决方案：为了使股票的40毫升：400毫克的apo -转（Sigma公司T2252），400毫克的BSA（Sigma公司A9647），存储为黄体酮的10μL（25毫克/毫升乙醇，混合40毫升Neurobasal分装于-20 ° C. Sigma公司P8783），64毫克腐胺（Sigma公司P7505），亚硒酸钠（30微米PBS中，作为分装保存于-20 ° C，西格玛S5261）和40μL。过滤消毒佐藤股市的解决方案，并储存为-20 ° C等分
神经元电镀液（下午）：Neurobasal中等，2％B27，2MM谷氨酰胺（100倍的股票，在-20℃，Invitrogen公司25030存储等分），25μm的谷氨酸（100种股票，分装储存在-20 ° C）和1％青霉素/链霉素。
神经元培养基（CM）：Neurobasal中等，2％B27，2MM谷氨酰胺（100倍的股票，分装储存在-20 ° C）和1％青霉素/链霉素。
5 FDU股票：100倍的股票，1mm的5 -氟-2' -脱氧尿苷（Sigma公司F0503）and1mM尿苷Neurobasal培养基（Sigma公司U3003）。过滤消毒，并作为分装储存在-20 ° C
木瓜蛋白酶消化解决方案（做出新的，以清扫前）：
- 溶解在4毫升DM 3.2毫克L -半胱氨酸（SIGMA的C - 7352）
- 1N氢氧化钠（pH试纸测试），在水浴地方调整pH值至7.4左右，在37 ° C
注：组织消化前执行下一个步骤（见下文）。 - 添加木瓜蛋白酶的终浓度为20单位/毫升
- 过滤消毒（0.22毫米），并于37℃水浴中放置° C
胰蛋白酶抑制剂的解决方案（做出新的，以清扫前）：
- 溶解0.2克胰蛋白酶抑制剂在20毫升马克（西格玛T7295）
- 检查pH值，用1N氢氧化钠调整pH值至7.4〜
- 过滤消毒，并在37℃水浴中放置° C
脑解剖
安装：
- 消毒的镊子和剪刀
- 70％的乙醇
- 清洁纸巾和diap二垫，在实验台上
- 用冰冷的替补的子宫和胎儿的DM10厘米培养皿
- 在解剖镜下ICE平台
- 2-36厘米菜与DM上的冰
- 暖日下午在37℃水浴
- 安乐死怀孕根据您的机构的动物保健批准的程序只Sprague - Dawley大鼠（E16）和我们委员会（IACUC）
- 为上腹部地区的尿布垫和绝育酒精的老鼠
- 使用镊子举行的腹部皮肤和一把剪刀，一个V形切口，切割只有皮肤
- 分开皮肤和使用另一消毒的镊子和剪刀穿过肌肉层
- 胚囊中提取的链，并转移到一个10厘米含有冰冷的DM菜
- 采用显微切割剪刀，小心地取出每一个胚胎，从每个胚胎囊和大脑，并释放到清洁10厘米菜与DM冰平台上的大脑
- 在层流罩下解剖镜下，脑/后脑部分删除，并用细钳去除脑膜，冰袋转移到一个新的6厘米菜与DM的清理皮层/海马
注：在这个阶段，组织准备内切酶消化。 - 将木瓜蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂的解决方案和过滤消毒
- 删除多余的DM从皮质/海马
- 添加4毫升准备木瓜蛋白酶消化解决方案
- 所有内容转移至50ml管，并在37℃水浴中放置猎鹰管℃，整整5分钟
- 用吸管取出木瓜蛋白酶溶液
- 添加为2-3分钟5毫升胰蛋白酶抑制剂的解决方案，旋流管，水浴中放置在37 ° C
- 删除胰蛋白酶抑制剂的解决方案
- 重复步骤13和14的三倍
- 加20ml的温暖！
- 磨碎已经消失，直到所有的团块（20-30倍）
- 在100xg离心为7分钟
- 悬浮于10ml PM的沉淀和离心洗两次
- 重悬沉淀于10ml下午进行定期的神经元文化或聚合文化NBB27/DMEM
- 穿过一个70μm的细胞筛细胞
- 活细胞计数
- 下文所述或钢板定期神经元培养的细胞聚合文化
注：在这一步，神经高度丰富的文化可以通过电镀到PDL的涂层板游离细胞密度在200-640细胞/ 毫米 2根据实验的目的。细胞附着后（1〜2 4小时），用温水下午取代的媒介。如果时间过长，在第4天，培养，取代以热烈的CM培养基的一半。 5 FDU（终浓度为10微米），对于高度纯化的神经元的文化，有丝分裂抑制剂，可以添加在DIV2抑制（即在DIV2 - 3，）非神经元细胞的增殖。 CM 2天的复苏后，细胞被脉冲治疗与5 - FDU再次为一个完整的中期变化的另外2天（6-7格）。此后，更换新鲜，每3-4天暖厘米中期的一半。长达4周的神经元是可行的。
聚合制备和电镀
- 暂停NBB27/DMEM介质中分离的细胞中含有1X佐藤在10ng/ml，CNTF和10μMforskolin的2 × 10 6细胞/ ml密度
- 细胞悬液转移到每一个无涂层的6孔板以及2毫升
- 文化3晚。每一天，轻轻悬浮细胞，一旦使用P1000的Pipetman
注：细胞开始形成聚集体（图1）。 - 总电镀的前一天，涂层板/与基质胶的盖玻片：
- 稀股票基质胶（生长因子减少，BD公司354230）用冷水冰的DMEM 1:20
注：基质胶分装，应按照制造商协议准备。所有的提示，Eppendorf管和股票等分的解决方案应冷，以避免基质胶聚合。基质胶分装保存于-80 ° C，并在4 ° C解冻 - 外套以前PDL涂层的盖玻片用300μl/well稀释后的基质胶溶液在37℃培养箱中过夜
- 用温水PBS洗净，然后用温暖无菌DDH 2 O板和离开孵化器板。
- 稀股票基质胶（生长因子减少，BD公司354230）用冷水冰的DMEM 1:20
- 聚合形成后3天，轻轻重悬细胞，再通过成50毫升猎鹰管200μm的丝网筛暂停。允许聚合解决试管底部的比重（1〜3分钟）
- 小心取出上清液
- 添加介质，轻轻悬浮聚合，并让他们重新定居。此过程重复几次以去除死细胞，单个细胞和碎片。用显微镜检查是否上清液中还含有非聚合的细胞和debri小号
- 轻轻重悬在同一NBB27/DMEM介质中的聚集（图1）和计数聚合
- 调整的聚集密度约25-30 aggreggats/50ul
- 传输等分总悬浮液（500 -1000μl）至2ml的Eppendorf管电镀
注：由于聚合倾向于安定下来的管底部，关键是使总悬浮的多个管镀。轻轻重悬之前往往播种到涂盖玻片或培养板，以确保每个盖玻片上镀聚合同样数量的聚集。 - 从孵化器中含有基质胶的涂布盖玻片取出培养板。从每口井的解决方案，用温暖的PBS和 DDH 2 O盖玻片，然后干燥简略。他们现在已经准备好为总播种
- 反转一个试管中总悬浮液，让他们可以均匀分布播种前。加载到每个盖玻片中心总悬浮液50μL，轻轻把板背面没有任何进一步的干扰，让骨料均匀地附着盖玻片孵化器
注：集料的密度是至关重要的。如果聚合种子太接近对方，或如果播种密度高，他们往往合并到一起，因为他们成长。 - 添加额外的DMEM/NBB27medium（500μL），每孔4-6 h后或第二天一大早
- 要保持总的文化，一半改变中期每3-4天。当改变培养基，小心，不要破坏聚合，这是轻轻沿井侧墙加入中等。
注：可以观察几个小时后，板块聚集，聚集的突起生长。轴突快速增长中的头两个星期，并形成丰富的聚合体（图2）之间的连接。神经胶质祖细胞移植放射状聚集，并随着时间的推移，分化成星形胶质细胞和成熟的少突胶质细胞。
图1，洗涤后在不同的日子和聚合形成聚集体细胞的相衬图像。
图2。期后在基质胶涂盖玻片的种子2和12天的总文化的对比度的图像。
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Discussion
早期的研究报告突触介导的转自由浮动总文化的成熟髓鞘的形成。这里描述的中枢神经系统的总文化系统在三个维聚集，与传统的2D文化便利，以促进细胞的发育，迁移和体外分化的分析相结合的无血清多能祖细胞的生长，可以修改系统和神经前体细胞神经胶质细胞相互作用的调查研究和。例如，如少突胶质祖细胞的转基因细胞5月2日被添加到总文化。如小胶质细胞和巨噬细胞或神经元和神经胶质细胞分化的发展和各种试剂的免疫细胞的影响，也可以研究。纯化的视网膜神经节细胞Reaggregates最近已在 3个其他细胞的情况下少突胶质细胞共同培养研究中枢神经系统的髓鞘。与以前的报告4一致，基质胶似乎优于PDL的，它促进细胞粘附和促进轴突生长和神经胶质细胞分化。因此，用作基质胶基质细胞聚集在此协议。
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Acknowledgments
这项研究是由部分启动资金，从得克萨斯A＆M大学
References
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