Beredning av Aggregate råtthjärna kulturer för Neuron och Glia utvecklingsstudier

Summary

Ett protokoll för en embryonal råtthjärna samlade kultur-systemet beskrivs. Multipotenta stamceller i aggregaten kan utveckla och differentiera till neuron, astrocyter och oligodendrocyter.

Abstract

En in vitro-system som rekapitulerar utveckling och differentiering av stamceller till mogna nervceller och Glia i det centrala nervsystemet (CNS) skulle ge en kraftfull plattform för neuroforskare att undersöka AXO-gliaceller interaktion, egenskaper och differentiering av multipotenta progenitorceller, och progression av oligodendroglial härstamning cellerna på cellulär och molekylär nivå. Vi beskriver här ett CNS-system samlade kulturen från embryonala råtta forebrains, som kan hållas i en serumfritt medelstora upp till 3-4 veckor och används i vårt laboratorium som modell för att studera neuron-Glia interaktion och CNS myelination. Detta videoklipp kommer att visa hur man isolera och odla dessa CNS sammanlagda kulturer från E16 råtta hjärnan. Vidare från samma hjärnan dissektion kan höganrikat regelbundna dissocierade neuronala kulturer vara lätt erhållas och användas för olika undersökningar om CNS-nervceller eller används för samarbete kulturer med andra celler.

Protocol

Förberedelser före dissekering

Kirurgiska instrument: sterilisera alla dissektion sax och pincett av autoklav

Täckglas rengöring:

1. Blötlägg alla täckglas (15 mm i diameter för 24-brunnar) i 1L gräs bägaren i 33% HCl i minst 24 timmar
2. Tvätta med rinnande vatten i 10 min med enstaka shake att ta bort alla rester av HCl
3. Skölj med Millipore vatten
4. Tappa vatten utanför
5. Blötlägg täckglas i 95-98% etanol
6. Överför täckglas till en ren vävnad på en plan platta och luft torka täckglasen
7. Överför täckglas till en glasbägare, täck med aluminiumfolie och autoklav
   Obs: Täckglas kan lagras i detta skede
8. Placera enskilda täckglas i odlingsplattor. Redo för beläggning

Täckglas beläggning:

1. Späd 100 x lager av poly-D-lysin (PDL, 10 mg / ml i 0,5% bovint serumalbumin i PBS, lagras som alikvoter vid -20 ° C) med PBS och filter-sterilisera (0,22 mikrometer)
2. Coat täckglas med 1 x PDL-lösning (~ 0,15 ml / cm ²⁾ under 2 h vid 37 ° C i en inkubator
3. Ta bort PDL-lösning och tvätta tre gånger med sterilt DDH ₂ O och torrt täckglas helt

Obs: Coat nog täckglas / plattor för varje dissekering. PDL-belagd täckglas kan lagras under några veckor vid 4 ° C.

Media och lösningar

Dissection medium (DM): Använd sterila iskalla Hanks Balanced Salt Solution (w / o Ca ^{2 +,} Mg ^{2 +)} (HBSS, Invitrogen 14.175) kompletterat med 10 mM HEPES (Invitrogen 15.630).

Aggregate kultur medier: DMEM/NBB27 mediet innehåller DMEM / Neurobasal (1:1 vol: vol), 2% B27, 1 x Sato, 0,5 mm natrium pyruvat, 0,75 mm GlutaMAX, 60μg/ml N-acetylcystein, 5 mikrogram / ​​ml insulin, 10Nm d-Biotin och 1% penicillin / streptomycin. För att göra 100 ml av det sammanlagda odlingsmedium, blanda 50 ml DMEM (w / o pyruvat / glutamin, Invitrogen 11.960), 50 ml Neurobasal medium (Invitrogen 211.034), 375 l GlutaMax (100 x, Invitrogen 35.050), 5,5 mg natrium pyruvat (Sigma P2256), 2 ml B27 (Invitrogen 17.504), 6,3 mg N-acetylcystein (Sigma A8199), 1 ml Sato lager (100 x lager, se nedan), 25 l av d-Biotin lager (4000 x lager, 40 mikroM i PBS lagras som alikvoter vid -20 ° C. Sigma B4639), 100 l av insulin 1000 x lager (, 5 mg / ml i 0.01N HCl lagras som alikvoter vid -20 ° C, Sigma 16.634) och 1 ml penicillin / streptomycin (100 x lager, Invitrogen 15.140), filter-sterilisera och förvara vid 4 ° C.

Sato 100 x stamlösning: För att göra 40 ml av: Blanda 40 ml Neurobasal med 400 mg apo-transferrin (Sigma T2252), 400 mg BSA (Sigma A9647), 10 ìl av progesteron 25 mg / ml etanol (, lagras som alikvoter vid -20 ° C. Sigma P8783), 64 mg Putrescine (Sigma P7505) och 40 ìl natriumselenit (30 mikrometer i PBS, lagras som alikvoter vid -20 ° C, Sigma S5261). Filtrera sterilisera Sato stamlösning, och lagrar som alikvoter vid -20 ° C.

Neuron plätering medium (PM): Neurobasal Medium, 2% B27, 2mm Glutamin (100x lager, alikvoter förvaras vid -20 ° C, Invitrogen 25.030), 25μM glutaminsyra (100 aktier, alikvoter förvaras vid -20 ° C) och 1% penicillin / streptomycin.

Neuron odlingsmedium (cm): Neurobasal Medium, 2% B27, 2mm Glutamin (100x lager, alikvoter förvaras vid -20 ° C) och 1% penicillin / streptomycin.

5-FDU lager: 100x lager, 1mm 5-fluoro-2'-deoxiuridin (Sigma F0503) and1mM uridin (Sigma U3003) i Neurobasal medium. Filtrera steriliseras och lagras som alikvoter vid -20 ° C.

Papain matsmältningen lösning (se färska före dissektion):

1. Lös 3,2 mg L-Cystein (Sigma C-7352) i 4ml DM
2. Justera pH till omkring 7,4 med 1N NaOH (testa på strips pH-test) och placera i vattenbad vid 37 ° C
   Observera: Utför nästa steg precis innan vävnad matsmältningen (se nedan).
3. Lägg papain till en slutlig koncentration på 20 enheter / ml
4. Filter sterilisera (0.22mm) och placera i vattenbad vid 37 ° C

Trypsininhibitorer lösning (se färska före dissektion):

1. Lös upp 0,2 g trypsin inhibitor (Sigma T7295) i 20ml DM
2. Kontrollera pH-värdet och justera pH till ~ 7,4 med 1 N NaOH
3. Filter sterilisera, och placera i vattenbad vid 37 ° C

Brain Dissection

Inställningar:

• Steriliserad pincett och sax
• 70% etanol
• Rengör mjukpapper och diapER pad på bänken
• 10cm petriskålar med iskall DM för livmodern och fostret på bänken
• Ice plattform vid dissektion mikroskop
• 2-3 6cm rätter med DM på is
• Varm PM i ett 37 ° C vattenbad

1. Euthanize en gravid Sprague-Dawley råtta (E16) enligt ett förfarande som godkänts av din Institutional Animal Care och Oss kommittén (IACUC)
2. Lägg råttan på blöjan pad och spay alkohol på bukhålan
3. Använd pincett för att hålla buken huden och en sax för att göra en V-form snitt skära bara huden
4. Sprid isär huden och använda en annan steriliserad pincett och sax för att klippa igenom muskellagret
5. Utdrag kedjan av embryot säckar och överföra dem till en 10cm skål med iskallt DM
6. Med hjälp av en microdissection sax, försiktigt bort varje embryo från sac och hjärnan från varje embryo, och placera befriade hjärnor i en ren 10cm tallrik med DM på en is-plattform
7. I ett laminärt huva och under en dissektion mikroskop, ta bort mitthjärnan / hindbrain sektioner och använd fina tång för att ta bort hjärnhinnor, och överföra den renade cortex / hippocampus till en ny 6cm rätt med DM på en is-pack
   Observera: i detta skede, är vävnaden redo för enzym matsmältningen.
8. Gör papain och trypsininhibitorerna lösning och filter sterilisera
9. Ta bort överflödigt DM från cortex / hippocampi
10. Tillsätt 4 ml av det beredda papain matsmältningen lösning
11. Överför allt innehåll i en 50 ml rör och placera Falcon röret i ett vattenbad vid 37 ° C i exakt 5 min
12. Ta bort papain lösning med pipett
13. Tillsätt 5 ml lösning trypsin inhibitor snurra röret och placera i ett vattenbad vid 37 ° C i 2-3 min
14. Ta bort trypsininhibitorerna lösning
15. Upprepa steg 13 och 14 tre gånger
16. Tillsätt 20 ml varm PM
17. Mal sönder tills alla klumpar har försvunnit (~ 20-30 gånger)
18. Centrifugera vid 100xg för 7min
19. Återsuspendera pelleten i 10 ml PM och tvätta två gånger genom centrifugering
20. Återsuspendera pelleten i 10 ml PM för regelbunden neuron kulturer eller NBB27/DMEM för sammanlagt kulturer
21. Passera celler genom en 70μm cell såll
22. Räkna levande celler
23. Fortsätt att aggregera kulturer som beskrivs nedan eller plattan cellerna för regelbunden neuron kulturer
    OBS: I detta steg kan höganrikat neuron kulturer uppnås genom bordläggning av dissocierade celler på PDL-beläggning plattorna vid täthet av 200-640 celler / mm ^2, beroende på syftet med experimenten. Efter celler har fäst (~ 2-4h), byt medium med varm PM. Om odling under längre tid, på dag 4, ersätta hälften av mediet med varm CM. För mycket renat neuronala kulturer, mitotiska hämmare 5-FDU (slutlig koncentration 10 mikrometer) kan läggas till DIV2 att hämma icke-neuronala cellproliferation (dvs under DIV2-3). Efter återhämtningen i CM i 2 dagar, celler puls åter behandlas med 5-FDU i ytterligare 2 dagar (DIV 6-7) följt av en komplett medelhög förändring. Därefter ersätta hälften av mediet med färska, varma CM var 3-4 dagar. Nervceller är lönsamt för upp till 4 veckor.

Aggregat förberedelse och plätering

1. Häng dissocierade celler i NBB27/DMEM medium som innehåller 1x Sato, 10ng/ml CNTF och 10μM Det ha vid en densitet av 2x10 ⁶ celler / ml
2. Överföring 2ml cellsuspension i varje brunn i en obestruket 6-brunnar
3. Kultur för 3 nätter. Varje dag försiktigt återsuspendera cellerna en gång med en P1000 Pipetman
   Obs: Celler börjar bilda aggregat (Figur 1).
4. På dagen innan sammanlagda plätering, päls skylt / täckglas med Matrigel:
   • Späd lager Matrigel (tillväxtfaktor minskas, BD Biosciences 354.230) 1:20 med kallt DMEM på is
     Obs: Matrigel portioner bör vara beredd enligt tillverkarens protokollet. Alla tips bör Eppendorf-rör och lösningar för att göra portioner av beståndet vara kallt för att undvika Matrigel polymerisation. Lika delar av Matrigel hålls vid -80 ° C och tinas vid 4 ° C.
   • Coat tidigare PDL-belagd täckglas med 300μl/well av den utspädda Matrigel lösningen över natten i ett 37 ° C inkubator
   • Tvätta med varmt PBS, tvätta sedan tallrik med varm steril DDH ₂ O och lämna plattorna i inkubatorn.
5. 3 dagar efter sammanlagt bildning, försiktigt resuspendera cellerna igen och sålla fjädring genom en 200μm maskor i en 50 ml Falcon rör. Låt aggregat att lösa till botten av röret genom självtryck (~ 3-5min)
6. Ta försiktigt bort supernatanten
7. Lägg medium försiktigt återsuspendera aggregat och låt dem lösa igen. Upprepa denna procedur flera gånger för att avlägsna döda celler, enskilda celler och skräp. Använd mikroskop för att kontrollera om supernatanten fortfarande innehålla icke-aggregerade celler och debris
8. Försiktigt resuspendera aggregaten i samma NBB27/DMEM medium (Figur 1) och räkna aggregat
9. Justera tätheten av aggregat till cirka 25-30 aggreggats/50ul
10. Överför alikvoter (500-1000μl) av den sammanlagda suspensionen 2 ml Eppendorf-rör för plätering
    OBS: Eftersom aggregat tenderar att slå sig ner till botten av rör, är det viktigt att göra flera tuber av det sammanlagda suspension för plätering. Försiktigt resuspendera aggregaten ofta innan sådd dem på bestruket täckglas eller plattor kultur för att garantera lika många aggregat pläterade på varje täckglas.
11. Ta ut den kultur skylt som innehåller Matrigel-belagd täckglasen från inkubatorn. Ta bort lösning från varje brunn, tvätta täckglas med varmt PBS och DDH ₂ O och sedan torka en kort stund. De är nu redo för aggregerad sådd
12. Invertera en tub som innehåller aggregerade fjädring så att de fördelas jämnt innan sådd. Ladda 50μl av stenmaterial suspensionen i mitten av varje täckglas, och försiktigt sätter tallriken tillbaka till inkubatorn utan ytterligare störningar att låta aggregaten att fästa jämnt på täckglas
    Obs: densitet aggregat är avgörande. Om aggregat är seedad för nära varandra eller om sådd densitet är hög, de tenderar att gå samman när de växer.
13. Lägg till ytterligare DMEM/NBB27medium (500 l) i varje brunn 4-6 timmar senare eller tidigt nästa morgon
14. Att behålla det totala kulturen, halv ändra mediet var 3-4 dagar. När förändringen medium, vara noga med att inte störa den aggregat och detta görs genom att försiktigt lägga medelstora längs väggen i brunnen.
    Notera: Några timmar efter aggregat fäst plattan, kan neurite utväxt från aggregat följas. Axoner växa snabbt under de första två veckorna och bildar rikligt med anslutningar mellan aggregat (figur 2). Gliaceller stamceller migrerar radiellt ut från aggregat och differentiera tiden i astrocyter och mogna oligodendrocyter.

Figur 1. Faskontrast bilder av celler som bildar aggregat på olika dagar och aggregat efter tvätt.

Figur 2. Faskontrast bilder av en samlad kultur 2 och 12 dagar efter seedade på Matrigel-belagda täckglas.

Discussion

Tidiga studier rapporterade bildning av synapser och mogna myelin i rotation-medierad fritt flytande aggregat kulturer ^1. CNS samlade kulturen som beskrivs här kombinerar serumfritt tillväxt av multipotenta stamceller i tredimensionell aggregat med bekvämligheten av traditionella 2D-kulturer för att underlätta analyser av cellens utveckling, migration och differentiering in vitro. Systemet kan anpassas och användas för neurala föregångare cell forskning och för utredning av neuron-Glia interaktioner. Till exempel ^två genetiskt modifierade celler som oligodendrocyte stamceller kan läggas till den samlade kulturer. Effekt av immunceller som mikroglia och makrofager eller olika reagenser på utveckling och differentiering av nervceller och Glia kan också studeras. Reaggregates renat retinal ganglion celler har nyligen använts för att studera CNS myelination i cocultures med oligodendrocyter i avsaknad av andra celler ^3. I samförstånd med föregående rapport ^4, verkar Matrigel vara överlägsna PDL genom att det främjar cell adhesion och påskyndar neurite utväxt och Glia differentiering. Matrigel används därför som underlaget för cellaggregat i detta protokoll.