Preparación de las Culturas Rata total del cerebro de las neuronas y la glía de Estudios para el Desarrollo

Summary

A los protocolos de un sistema de cerebro de rata embrionaria cultura global se describe. Progenitoras multipotentes en los agregados pueden desarrollarse y diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos.

Abstract

Un sistema in vitro que recapitula el desarrollo y diferenciación de células progenitoras en neuronas maduras y células gliales en el sistema nervioso central (SNC) que proporcionan una poderosa plataforma para los neurocientíficos para investigar axo-glial interacciones, propiedades y la diferenciación de células progenitoras multipotentes, y la progresión de oligodendroglial células de linaje en el nivel celular y molecular. Se describe aquí un total de SNC sistema de cultivo de prosencéfalos embrionario de la rata, que puede ser mantenido en un medio libre de suero hasta 3-4 semanas y se utiliza en nuestro laboratorio como un modelo para estudiar las neuronas-glia la interacción y la mielinización del SNC. Este video clip se mostrará cómo aislar y cultivar estas culturas agregada del SNC de cerebro de rata E16. Además, a partir de la disección del cerebro mismo, altamente enriquecido regulares cultivos de neuronas disociadas se pueden obtener fácilmente y se utiliza para diversos estudios sobre las neuronas del SNC o utilizados para co-cultivos con otras células.

Protocol

Preparación antes de la disección

Instrumentos quirúrgicos: esterilizar todos tijeras y pinzas de disección por autoclave

Cubreobjetos de limpieza:

1. Ponga todos los cubreobjetos (15 mm de diámetro por 24 y placa) en el vaso 1 litro de hierba en el 33% de HCl por lo menos 24 h
2. Lavar con agua corriente durante 10 minutos con un movimiento de vez en cuando para eliminar todo residuo de HCl
3. Enjuague con agua Millipore
4. Drenar el agua
5. Remoje cubreobjetos en el 95-98% de etanol
6. Cubreobjetos traslado a un paño limpio sobre una placa plana y el aire seco del cubreobjetos
7. Transferencia cubreobjetos a un vaso de vidrio, cubrir con papel de aluminio y autoclave
   Nota: Los cubreobjetos se pueden almacenar en esta etapa
8. Coloque el cubreobjetos individuales en placas de cultivo. Listo para el revestimiento

Cubreobjetos recubrimiento:

1. Diluir 100 acciones x de poli-D-lisina (PDL, 10 mg / ml en el 0,5% de albúmina sérica bovina en PBS, almacenados en alícuotas a -20 ° C) con PBS y el filtro de esterilización (0,22 m)
2. Cubreobjetos cubrir con una solución x PDL (~ 0,15 ml / cm ²⁾ durante 2 horas a 37 ° C en una incubadora
3. Retire la solución PDL y lavar 3 veces con agua estéril O ddH ₂ y cubreobjetos se seque por completo

Nota: El pelo lo suficientemente cubreobjetos / placas para cada disección. PDL recubierto cubreobjetos se puede almacenar durante un par de semanas a 4 ° C.

Los medios de comunicación y soluciones

Medio de la disección (DM): El uso de solución salina equilibrada estéril helada de Hank (w / o Ca ^{2 +,} Mg ^{2 +)} (HBSS, Invitrogen 14.175), complementado con HEPES 10 mM (Invitrogen 15630).

Los medios de comunicación agregado cultural: El medio DMEM/NBB27 contiene DMEM / Neurobasal (1:1 vol: vol), el 2% B27, 1 x Sato, 0,5 mM piruvato sódico, 0,75 Glutamax, 60μg/ml N-acetilcisteína, 5 mg / ml la insulina, 10 nM d-biotina y el 1% penicilina / estreptomicina. Para hacer 100 ml del medio de cultivo total, mezclar 50 ml de DMEM (w / o piruvato / glutamina, Invitrogen 11.960), 50 ml de medio Neurobasal (Invitrogen 211.034), 375 l Glutamax (100 x, Invitrogen 35.050), 5,5 mg de sodio piruvato (Sigma P2256), 2 ml B27 (Invitrogen 17.504), 6,3 mg de N-acetilcisteína (Sigma A8199), 1 ml de Sato acciones (100 acciones x, ver más abajo), 25 l de d-biotina madre (4000 x acciones, 40 M en PBS almacenado en alícuotas a -20 ° C. Sigma B4639), 100 l de la insulina (1000 x stock, 5 mg / ml de HCl 0,01 N almacenado en alícuotas a -20 ° C, Sigma 16 634), y 1 ml de penicilina / estreptomicina (100 x acciones, Invitrogen 15.140), filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C.

Sato 100 x solución de reserva: Para hacer 40 ml de la acción: mezcla de 40 ml Neurobasal con 400 mg apo-transferrina (Sigma T2252), 400 mg de BSA (Sigma A9647), 10 l de progesterona (25 mg / ml de etanol, se almacena como alícuotas a -20 ° C. Sigma P8783), 64 mg putrescina (Sigma P7505), y 40 l de selenito de sodio (30 mM en PBS, almacenados en alícuotas a -20 ° C, Sigma S5261). Filtro de esterilización de la solución madre de Sato, y almacenar en alícuotas a -20 ° C.

Neurona medio chapado (PM): Media Neurobasal, el 2% B27, 2 mM de glutamina (stock 100x, alícuotas almacenadas a -20 ° C, Invitrogen 25.030), 25μM ácido glutámico (100 acciones, alícuotas almacenadas a -20 ° C) y el 1% penicilina / estreptomicina.

Neurona medio de cultivo (CM): Media Neurobasal, el 2% B27, 2 mM de glutamina (stock 100x, alícuotas almacenadas a -20 ° C) y 1% de penicilina / estreptomicina.

5-FdU acciones: acciones 100x, 1mM 5-fluoro-2'-desoxiuridina (Sigma F0503) and1mM uridina (Sigma U3003) en medio de Neurobasal. Filtro esterilizado y almacenado en alícuotas a -20 ° C.

La papaína solución de digestión (hace fresco antes de la disección):

1. Disolver 3,2 mg L-cisteína (Sigma C-7352) en 4 ml de DM
2. Ajustar el pH a aproximadamente 7,4 con NaOH 1 N (prueba de tiras reactivas de pH) y en un baño de agua a 37 ° C
   Nota: Realice el siguiente paso justo antes de la digestión del tejido (ver más abajo).
3. Añadir la papaína a una concentración final de 20 unidades / ml
4. Filtro de esterilización (0.22mm), y en un baño de agua a 37 ° C

Tripsina inhibidor de la solución (que inmediatamente antes de su disección):

1. Disolver 0,2 g de inhibidor de tripsina (Sigma T7295) en 20 ml DM
2. Verificar el pH y ajustar el pH a ~ 7,4 con NaOH 1 N
3. Filtro de esterilización, y en un baño de agua a 37 ° C

La disección del cerebro

Configuración:

• Pinzas esterilizadas y tijeras
• 70% de etanol
• Un pañuelo de papel limpio y DIAPer pad en el banco
• Platos de Petri de 10 cm con helado de DM para el útero y el feto en el banco
• De hielo en la plataforma microscopio de disección
• 2-3 platos de 6 cm con DM en el hielo
• PM caliente en un baño de agua 37 ° C

1. La eutanasia a una mujer embarazada de ratas Sprague-Dawley (E16) de acuerdo con un procedimiento aprobado por el Comité Institucional de nosotros Comité (IACUC)
2. Sentar las ratas en la plataforma de pañal y el alcohol de esterilización en la región abdominal
3. Use pinzas para sujetar la piel abdominal y un par de tijeras para hacer una incisión en forma de V corta solamente la piel
4. Separe la piel y el uso de otro pinzas esterilizadas y las tijeras para cortar a través de la capa muscular
5. Extracto de la cadena de los sacos embrionarios y transferirlos a un plato de 10 cm que contiene helada DM
6. Utilizando unas tijeras de microdisección, retire con cuidado cada embrión del saco y el cerebro de cada embrión, y el lugar liberado cerebro en un plato de 10cm limpio con DM en una plataforma de hielo
7. En una campana de laminar y bajo un microscopio de disección, retirar el cerebro medio / rombencéfalo secciones, y el uso de unas pinzas finas para eliminar las meninges, y la transferencia de la corteza limpia / hipocampo de un nuevo plato con 6 cm de DM en una bolsa de hielo
   Nota: en esta etapa, el tejido está listo para su digestión por enzimas.
8. Hacer la papaína y la solución de inhibidor de la tripsina y el filtro de esterilización
9. Eliminar el exceso de DM de corteza / hipocampo
10. Agregar 4 ml de la solución de papaína digestión preparado
11. La transferencia de todo el contenido de un tubo de 50 ml y colocar el tubo Falcon en un baño de agua a 37 ° C durante exactamente 5 minutos
12. Retire la solución con una pipeta de la papaína
13. Añadir 5 ml de solución de inhibidor de la tripsina, agitar el tubo, y colocar en un baño de agua a 37 ° C durante 2-3 minutos
14. Eliminar la solución de inhibidor de tripsina
15. Repita el paso 13 y 14 tres veces
16. Añadir PM caliente 20ml
17. Triturar hasta que todos los grupos han desaparecido (~ 20 a 30 veces)
18. Centrifugar a 100xg de 7min
19. Resuspender el precipitado en 10 ml de PM y lavar dos veces por centrifugación
20. Resuspender el precipitado en 10 ml de cultivos de neuronas PM regular o en NBB27/DMEM de las culturas agregado
21. Pasar a las células a través de un tamiz de células 70μm
22. Contador de células vivas
23. Proceder a la cultura global, como se describe a continuación o la placa de las células de cultivos de neuronas regulares
    Nota: En este paso, altamente enriquecido cultivos de neuronas se puede lograr mediante siembra de las células disociadas en las placas de recubrimiento PDL-con una densidad de 200 a 640 células / mm ² en función de la finalidad de los experimentos. Después las células se han conectado (~ 2-4h), reemplace medio con PM caliente. Si el cultivo durante períodos prolongados de tiempo, el día 4, reemplace la mitad de la media con CM caliente. Para altamente purificada cultivos neuronales, inhibidor de la mitosis 5 FdU (concentración final 10 mM) se puede añadir en DIV2 para inhibir la no proliferación de las células neuronales (es decir, durante DIV2-3). Después de la recuperación en la CM durante 2 días, las células son el pulso de nuevo al tratamiento con 5-FdU durante 2 días (DIV 6-7) seguido de un cambio de medio completo. A partir de entonces, reemplazar la mitad de la media con CM dulce, caliente cada 3-4 días. Las neuronas son viables hasta por 4 semanas.

Agregados de preparación y de las planchas

1. Suspender las células disociadas en el medio que contiene 1x NBB27/DMEM Sato, CNTF 10ng/ml y forskolin 10μM a una densidad de 2x10 ⁶ células / ml
2. Transferencia de 2 ml de suspensión celular en cada pocillo de un sin recubrimiento de 6 pocillos
3. Cultura por 3 noches. Cada día, suavemente volver a suspender las células una vez con un Pipetman P1000
   Nota: Las células comienzan a formar agregados (Figura 1).
4. En el día de las placas, agregado, la capa de placa / cubreobjetos con Matrigel:
   • Diluir acciones Matrigel (factor de crecimiento reducido, BD Biosciences 354230) 1:20 con DMEM frío en hielo
     Nota: alícuotas de Matrigel debe ser preparado por el protocolo del fabricante. Todas las puntas, tubos Eppendorf y soluciones para la toma de alícuotas de las acciones debe estar fría para evitar la polimerización Matrigel. Alícuotas de Matrigel se mantienen a -80 ° C y se descongelaron a 4 ° C.
   • Escudo previamente PDL-cubreobjetos recubiertos con 300μl/well de la solución diluida Matrigel durante la noche en una incubadora a 37 ° C
   • Lavar con PBS caliente, lavar la placa con agua tibia estéril O ddH ₂ y dejar las placas en la incubadora.
5. 3 días después de la formación de agregados, resuspender suavemente las células de nuevo y se tamiza la suspensión a través de una malla de 200μm en un tubo de 50 ml Falcon. Permita que los agregados se depositen en el fondo del tubo por la gravedad (~ 3-5min)
6. Retire con cuidado el sobrenadante
7. Añadir medio, suavemente volver a suspender los agregados y dejar a establecerse de nuevo. Repita este procedimiento varias veces para eliminar las células muertas, las células individuales y los escombros. Use el microscopio para verificar si el sobrenadante aún contienen las células no agregados y basuras
8. Resuspenda suavemente los agregados en el medio NBB27/DMEM mismo (Figura 1) y el recuento de los agregados
9. Ajustar la densidad de los agregados de alrededor de 25-30 aggreggats/50ul
10. Transferencia de alícuotas (500-1000μl) de la suspensión total de 2 ml tubos Eppendorf para la siembra
    Nota: Dado que los agregados tienden a asentarse en el fondo de los tubos, es crucial para hacer tubos múltiples de la suspensión total para la siembra. Resuspenda suavemente los agregados a menudo antes de la siembra que en cubreobjetos recubiertos o placas de cultivo para garantizar un número similar de agregados chapada en cada portaobjetos.
11. Saque la placa de cultivo que contienen Matrigel recubierto cubreobjetos de la incubadora. Retire la solución de cada pocillo, lavar los cubreobjetos con PBS caliente y se _ddH2O, y luego brevemente en seco. Ahora están listos para la siembra de agregado
12. Invertir un tubo que contiene la suspensión total para que puedan ser distribuidos de manera uniforme antes de la siembra. Carga 50μl de la suspensión total en el centro de cada cubreobjetos, y colocó suavemente la placa posterior a la incubadora sin ningún tipo de perturbación adicional para permitir que los agregados para fijar de manera uniforme para el cubreobjetos
    Nota: La densidad de los agregados es crucial. Si los agregados se siembran demasiado cerca uno del otro o si la densidad de siembra es alta, tienden a fusionarse a medida que crecen.
13. Añadir DMEM/NBB27medium adicionales (500 l) a cada pocillo 4-6 horas más tarde o temprano la mañana siguiente
14. Para mantener la cultura global, la mitad de cambiar el medio cada 3-4 días. Cuando cambio de medio, tenga cuidado de no romper los agregados y esto se hace añadiendo lentamente un medio a lo largo de la pared lateral del pozo.
    Nota: Pocas horas después de agregados unida a la placa, crecimiento de las neuritas de los agregados se pueden observar. Los axones crecen rápidamente en las primeras dos semanas y forman abundantes conexiones entre los agregados (Figura 2). Gliales progenitores migran radialmente hacia fuera de los agregados y se diferencian en el tiempo en los astrocitos y oligodendrocitos maduros.

Figura 1. Imágenes de contraste de fase de células que forman los agregados en diferentes días y agregados después del lavado.

Figura 2. Imágenes de contraste de fase de una cultura global 2 y 12 días después de sembradas en Matrigel recubierto cubreobjetos.

Discussion

Los primeros estudios informó la formación de sinapsis y de la mielina madura libre mediada la rotación de cultivos de agregados flotantes ^1. El agregado del SNC sistema de cultivo se describe aquí se combina el suero libre de crecimiento de las células progenitoras multipotentes en tres dimensiones con los agregados de la comodidad de las culturas tradicionales en 2D para facilitar el análisis de desarrollo de las células, la migración y la diferenciación in vitro. El sistema puede ser modificado y usado para precursoras neuronales la investigación con células y para la investigación de las interacciones de las células de las neuronas. Por ejemplo, las células modificadas genéticamente, tales como los progenitores de oligodendrocitos ² puede ser agregado a los cultivos agregado. Efecto de las células inmunes como los macrófagos y microglia o varios reactivos en el desarrollo y diferenciación de las neuronas y células gliales pueden ser también estudiados. Reaggregates purificado de las células ganglionares de la retina se han utilizado recientemente para estudiar la mielinización del SNC en co-cultivos de oligodendrocitos en ausencia de otras células ^3. De acuerdo con el informe anterior ^4, Matrigel parece ser superior al PDL, ya que promueve la adhesión de las células y acelera el crecimiento de las neuritas y la diferenciación de células gliales. Matrigel lo tanto se utiliza como sustrato para los agregados de células en el presente Protocolo.