Préparation des cultures de cerveau de rat d'agrégation pour Neuron et études sur le développement Glia

Summary

Un des protocoles pour un système de cerveau de rat culture embryonnaire agrégat est décrite. Progéniteurs multipotentes dans les agrégats peuvent se développer et se différencier en neurones, astrocytes et des oligodendrocytes.

Abstract

Un système in vitro qui récapitule le développement et la différenciation des progéniteurs en neurones matures et des cellules gliales dans le système nerveux central (SNC) offrirait une plateforme puissante pour les neuroscientifiques pour enquêter sur les interactions axo-gliales, les propriétés et la différenciation des progéniteurs multipotentes, et la progression de oligodendrogliales cellules lignée au niveau cellulaire et moléculaire. Nous décrivons ici un système de culture de SNC agrégées de forebrains rats embryonnaires, qui peuvent être maintenues dans un milieu sans sérum à 3-4 semaines et est utilisé dans notre laboratoire comme un modèle pour étudier l'interaction neurone-glie et la myélinisation du SNC. Ce clip vidéo vous montrera comment isoler et cultiver ces cultures SNC global du cerveau de rat E16. Par ailleurs, à partir de la dissection du cerveau même, hautement enrichi régulièrement dissociée cultures neuronales peuvent être facilement obtenues et utilisées pour les différentes études sur les neurones du SNC ou utilisés pour des co-cultures avec d'autres cellules.

Protocol

Préparation avant dissection

Outils chirurgicaux: stériliser tous les ciseaux de dissection et une pince en autoclave

Nettoyage de la lamelle:

1. Faire tremper les lamelles (15mm de diamètre pour 24 puits, plaque) dans 1L bécher herbe dans 33% de HCl pendant au moins 24 h
2. Laver à l'eau courante pendant 10 min avec secouez occasionnelle pour supprimer tous les résidus de HCl
3. Rincer à l'eau Millipore
4. Égoutter l'eau hors
5. Faire tremper dans de l'éthanol lamelles 95-98%
6. Lamelles Transférer dans un mouchoir en papier propre sur une plaque plate et l'air sec les lamelles
7. Transfert des lamelles d'un récipient en verre, couvrir de papier aluminium et autoclaver
   Remarque: Lamelles peuvent être stockées à ce stade
8. Placer la lamelle individuels dans des boîtes de culture. Prêt pour le revêtement

Lamelle de revêtement:

1. Diluer 100 x stocks de poly-D-lysine (PDL, 10 mg / ml dans du sérum bovin 0,5% d'albumine dans le PBS, stockées sous forme d'aliquots à -20 ° C) avec du PBS et le filtre de stériliser (0,22 um)
2. Manteau lamelles avec 1 x PDL solution (~ 0,15 ml / cm ²⁾ pendant 2 h à 37 ° C dans un incubateur
3. Retirer solution de PDL et laver 3 fois avec O stériles ddH ₂ et lamelles sécher complètement

Remarque: Le poil assez de lamelles / plaques pour chaque dissection. PDL-revêtement des lamelles peuvent être stockées pendant quelques semaines à 4 ° C.

Médias et des solutions

Dissection moyenne (DM): Utiliser une solution stérile glacée saline équilibrée de Hank (w / o Ca ^{2 +,} Mg ^{2 +)} (HBSS, Invitrogen 14175) supplémenté avec 10 mM HEPES (Invitrogen 15630).

Milieux de culture globale: Le milieu contient DMEM/NBB27 DMEM / Neurobasal (1:1 vol: vol), 2% B27, 1 x Sato, 0,5 mM pyruvate de sodium, 0,75 glutamax, 60μg/ml N-acétylcystéine, 5 pg / ml insuline, 10 nM d-biotine et 1% de pénicilline / streptomycine. Pour faire 100 ml de milieu de culture globale, mélanger 50 ml de DMEM (w / o pyruvate / glutamine, Invitrogen 11960), 50 ml de milieu Neurobasal (Invitrogen 211 034), 375 ul glutamax (100 x 35 050 Invitrogen), 5,5 mg de sodium pyruvate (Sigma p2256), 2 ml B27 (Invitrogen 17504), 6,3 mg N-acétylcystéine (Sigma A8199), 1 ml de Sato des stocks (100 x stocks, voir ci-dessous), 25 pl de d-biotine stock (4000 x stock, 40 uM dans du PBS stockées sous forme d'aliquots à -20 ° C. Sigma B4639), 100 ul de l'insuline (1000 x stock, 5 mg / ml dans HCl 0,01 N stockées sous forme d'aliquots à -20 ° C, Sigma 16 634), et 1 ml de pénicilline / streptomycine (100 x stock, Invitrogen 15140), filtre à stériliser et stocker à 4 ° C.

Sato 100 x solution stock: Pour 40 ml du stock: mélanger 40 ml Neurobasal avec 400 mg d'apo-transferrine (Sigma T2252), 400 mg de BSA (Sigma A9647), 10 pl de la progestérone (25 mg / ml d'éthanol, stockées sous forme de aliquotes à -20 ° C. Sigma P8783), 64 mg putrescine (Sigma P7505), et 40 pi de sélénite de sodium (30 uM dans du PBS, stockées sous forme d'aliquots à -20 ° C, Sigma S5261). Filtre stériliser la solution stock de Sato, et de stocker en aliquotes à -20 ° C.

Milieu d'étalement Neuron (PM): Moyen Neurobasal, 2% B27, 2 mM glutamine (stock 100x, aliquotes conservés à -20 ° C, Invitrogen 25030), 25 um d'acide glutamique (100 stock, aliquotes conservés à -20 ° C) et 1% pénicilline / streptomycine.

Milieu de culture Neuron (CM): Moyen Neurobasal, 2% B27, 2 mM glutamine (stock 100x, aliquotes conservés à -20 ° C) et 1% de pénicilline / streptomycine.

5 FdU Stock: 100x, 1 mM de 5-fluoro-2'-désoxyuridine (Sigma F0503) and1mM uridine (Sigma U3003) en milieu Neurobasal. Filtre stérilisés et stockés sous forme d'aliquots à -20 ° C.

Solution de digestion par la papaïne (assurez frais avant dissection):

1. Dissoudre 3,2 mg de L-cystéine (Sigma C-7352) dans 4ml DM
2. Ajuster le pH à environ 7,4 avec NaOH 1N (test sur bandelettes pH) et placer dans un bain d'eau à 37 ° C
   Remarque: Effectuez l'étape suivante juste avant la digestion des tissus (voir ci-dessous).
3. Ajouter la papaïne à une concentration finale de 20 unités / ml
4. Stériliser par filtration (0,22 mm), et placer dans un bain d'eau à 37 ° C

Solution d'inhibiteur de trypsine (assurez frais avant dissection):

1. Dissoudre 0,2 g d'inhibiteur de trypsine (Sigma T7295) dans 20ml DM
2. Vérifier le pH et ajuster le pH à ~ 7,4 avec NaOH 1 N
3. Stériliser par filtration, et placer dans un bain d'eau à 37 ° C

Dissection du cerveau

Configuration:

• Pinces stérilisées et ciseaux
• 70% d'éthanol
• Papiers tissu propre et DIAPER pad sur le banc
• Boîtes de Pétri de 10 cm avec glacée DM pour l'utérus et le fœtus sur le banc
• Plate-forme de glace au microscope à dissection
• 2-3 plats 6cm avec DM sur la glace
• PM chaud dans un bain à 37 ° C l'eau

1. Euthanasier un rates Sprague-Dawley rats (E16) selon une procédure approuvée par votre Animal Care institutionnels et nous Comité (IACUC)
2. Posez le rat sur le pavé de couches et de l'alcool spay sur la région abdominale
3. Utilisez une pince à épiler pour maintenir la peau abdominale et une paire de ciseaux pour faire une incision en forme de V uniquement la coupe de la peau
4. Écartez la peau et utiliser un autre pincettes stérilisées et les ciseaux pour couper à travers la couche musculaire
5. Extrait de la chaîne des sacs embryon et les transférer dans un plat de 10cm contenant glacée DM
6. En utilisant une paire de ciseaux de microdissection, retirez soigneusement chaque embryon du sac et le cerveau de chaque embryon, et la place libérée des cerveaux dans un plat de 10cm nettoyer avec DM sur une plate-forme de glace
7. Dans une hotte laminaire et sous un microscope de dissection, retirer du mésencéphale / rhombencéphale sections, et d'utiliser une pince fine pour retirer les méninges, et le transfert du cortex nettoyé / hippocampe d'un nouveau plat 6cm avec DM sur un sac de glace
   Note: à ce stade, le tissu est prêt pour la digestion enzymatique.
8. Faire la papaïne et la solution d'inhibiteur de trypsine et stériliser par filtration
9. Enlever l'excès de DM cortex / hippocampes
10. Ajouter 4 ml de la solution préparée digestion par la papaïne
11. Transfert tout le contenu d'un tube de 50 ml et placer le tube Falcon dans un bain d'eau à 37 ° C pendant exactement 5 minutes
12. Retirer solution de papaïne avec pipette
13. Ajouter 5 ml solution inhibiteur de la trypsine, agiter le tube, et les placer dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 2-3 min
14. Retirer solution inhibiteur de la trypsine
15. Répétez l'étape 13 et 14 trois fois
16. Ajouter 20ml PM chaude
17. Triturer jusqu'à ce que tous touffes ont disparu (~ 20-30 fois)
18. Centrifuger à 100xg pour 7min
19. Reprendre le culot dans 10ml PM et laver deux fois par centrifugation
20. Reprendre le culot dans 10ml PM pour des cultures de neurones régulière ou dans NBB27/DMEM pour les cultures globales
21. Passez les cellules à travers un tamis cellulaire 70μm
22. Nombre des cellules vivantes
23. Procéder à des cultures globales décrites ci-dessous ou la plaque des cellules pour des cultures de neurones régulière
    Note: À cette étape, hautement enrichi des cultures de neurones peut être atteint par les cellules dissociées plaquage sur PDL-revêtement des plaques à une densité de 200 à 640 cellules / mm ² selon l'objet d'expérimentations. Après les cellules ont attaché (~ 2-4h), remplacer moyenne avec PM chaud. Si la culture pendant de longues périodes de temps, le jour 4, remplacer la moitié de la moyenne avec CM chaud. Pour hautement purifiée cultures de neurones, inhibiteur mitotique 5-UPF (concentration finale 10 pM) peuvent être ajoutés à DIV2 pour inhiber la prolifération des cellules non-neuronales (c'est à dire, pendant DIV2-3). Après la récupération de CM pendant 2 jours, les cellules sont traitées à nouveau d'impulsion avec le 5-FdU pendant 2 jours (DIV 6-7) suivie d'un changement de milieu complet. Par la suite, remplacez la moitié de la moyenne avec des produits frais, CM chaude tous les 3-4 jours. Les neurones sont viables jusqu'à 4 semaines.

Préparation de granulats et de placage

1. Suspendre les cellules dissociées en milieu NBB27/DMEM contenant 1x Sato, 10ng/ml CNTF et 10 uM de forskoline à une densité de 2x10 ⁶ cellules / ml
2. Transfert 2ml de suspension cellulaire dans chaque puits d'une non couchés à 6 puits plaque
3. Culture pour 3 nuits. Chaque jour, doucement remettre en suspension les cellules une fois en utilisant un Pipetman P1000
   Remarque: les cellules commencent à former des agrégats (Figure 1).
4. Le jour avant l'étalement global, manteau plaque / lamelles de Matrigel:
   • Diluer stock de Matrigel (facteur de croissance réduite, BD Biosciences 354230) 01:20 avec le froid DMEM sur la glace
     Remarque: aliquotes Matrigel devrait être préparé par le protocole du fabricant. Toutes les astuces, des tubes Eppendorf et des solutions pour faire des aliquotes du stock doit être froide pour éviter la polymérisation Matrigel. Des aliquotes de Matrigel sont conservés à -80 ° C et décongelés à 4 ° C.
   • Manteau préalablement enduit de PDL lamelles avec 300μl/well de la solution diluée Matrigel nuit dans un incubateur à 37 ° C
   • Laver avec du PBS tiède, puis lavez-plaque avec chaleureuse stériles O ddH ₂ et laissez les plaques dans l'incubateur.
5. 3 jours après la formation d'agrégats, doucement resuspendre les cellules à nouveau et tamisez la suspension à travers un maillage de 200μm dans un tube de 50ml Falcon. Autoriser les agrégats se déposent au fond du tube par gravité (~ 3-5min)
6. Retirer délicatement le surnageant
7. Ajouter moyen, délicatement remettre en suspension les agrégats et les laisser s'installer de nouveau. Répétez cette procédure plusieurs fois pour éliminer les cellules mortes, les cellules individuelles et de débris. Utilisez microscope pour vérifier si le surnageant contiennent encore non agrégées cellules et debris
8. Resuspendre doucement les agrégats dans la moyenne NBB27/DMEM mêmes (figure 1) et le nombre d'agrégats
9. Réglez la densité d'agrégats d'environ 25-30 aggreggats/50ul
10. Aliquotes de transfert (500-1000μl) de la suspension totale de 2ml tubes Eppendorf pour le placage
    Remarque: Comme les agrégats ont tendance à s'installer au fond des tubes, il est crucial de faire de multiples tubes de la suspension totale pour le placage. Resuspendre doucement les agrégats souvent avant les ensemençant sur des lamelles enduites ou des plaques de culture afin d'assurer le même nombre d'agrégats plaqués sur chaque lamelle.
11. Sortez la plaque de culture contenant de Matrigel enduit de lamelles de l'incubateur. Retirer solution à partir de chaque puits, se laver les lamelles avec du PBS et chaleureuse ddH ₂ O, puis brièvement à sec. Ils sont maintenant prêts pour l'ensemencement global
12. Inverser un tube contenant la suspension totale de leur permettre d'être distribué uniformément avant l'ensemencement. Charge 50 pl de la suspension totale dans le centre de chaque lamelle, et posa doucement la plaque arrière de l'incubateur sans aucune perturbation supplémentaire pour permettre d'attacher des agrégats uniformément sur la lamelle
    Note: La densité des agrégats est cruciale. Si les agrégats sont ensemencées trop près les uns aux autres ou si la densité de semis est élevée, ils ont tendance à fusionner à mesure qu'ils grandissent.
13. Ajouter DMEM/NBB27medium supplémentaires (500 pi) dans chaque puits 4-6 h plus tard ou tôt le lendemain matin
14. Afin de maintenir la culture globale, la moitié changer le milieu tous les 3-4 jours. Quand le changement moyen, attention à ne pas perturber les agrégats et cela se fait en ajoutant doucement moyenne le long du mur côté du bien.
    Remarque: Quelques heures après agrégats attaché à la plaque, la croissance des neurites des agrégats peuvent être observés. Les axones se développent rapidement dans les deux premières semaines et de former des connexions entre les agrégats abondants (figure 2). Progéniteurs gliales migrent radialement des agrégats et de se différencier au cours du temps en astrocytes et des oligodendrocytes matures.

Figure 1. Images par contraste de phase de cellules formant des agrégats à des jours différents et des agrégats après le lavage.

Figure 2. Images par contraste de phase d'une culture globale de 2 à 12 jours après ensemencées sur Matrigel revêtement des lamelles.

Discussion

Les premières études a signalé la formation de synapses et de myéline mature dans la rotation des cultures libres à médiation globale flottant ^1. Le système CNS culture globale décrite ici combine sans sérum de croissance des cellules progénitrices multipotentes en trois dimensions des agrégats avec la commodité de cultures traditionnelles en 2D pour faciliter les analyses du développement cellulaire, la migration et la différenciation in vitro. Le système peut être modifié et utilisé pour les précurseurs neuronaux recherche sur les cellules et pour enquête interactions neurone-glie. Par exemple, les cellules génétiquement modifiées telles que les progéniteurs d'oligodendrocytes ² peut être ajouté aux cultures globales. Effet des cellules immunitaires telles que la microglie et les macrophages ou les divers réactifs sur le développement et la différenciation des neurones et cellules gliales peuvent également être étudiés. Reaggregates purifié cellules ganglionnaires rétiniennes ont récemment été utilisés pour étudier la myélinisation du SNC chez cocultures avec des oligodendrocytes en l'absence d'autres cellules ^3. En accord avec le rapport précédent ^4, Matrigel semble être supérieure à PDL en ce qu'elle favorise l'adhérence des cellules et accélère la croissance des neurites et la différenciation des cellules gliales. Matrigel est donc utilisé comme substrat pour les agrégats de cellules dans ce protocole.