負傷ラット脊髄を修復するために末梢神経移植とマトリックスモジュレーションを組み合わせ

Summary

脊髄への外傷は、脳との通信が中断されます。失われた接続を復元するために我々は、長距離の成長を促進するための阻害分子を除去する神経栄養因子とマトリックス調節酵素と組み合わせて再生繊維のために基体を提供するために、末梢神経移植片を利用しています。

Abstract

脊髄（SCI）への外傷はニューロン、運動感覚神経線維（軸索）経路と脳との通信の混乱の混乱の死を引き起こす。私たちの研究の目標の一つは、損傷部位間の接続を復元するために軸索再生を促進することである。これを達成するために我々は、坐骨神経のセグメントはどちら脊髄の損傷端部間に直接配置されているまたは病変を渡る橋を形成するために使用される技法を移植末梢神経（PN）を開発。このアプローチには、いくつかの利点が他の神経組織の移植と比較してある、再生軸索が特​​定のターゲットエリアに向かって指示することができる、再生成する軸索の数とソースが簡単にテクニックを追跡することによって決定される、移植片は、測定する電気生理学実験に使用することができます機能回復は、移植片の軸索に関連付けられ、そしてそれは、移植片拒絶反応の可能性を低減するために、自家神経を使用することが可能です。私たちの研究室では、同等の結果との両方の自己（ドナーとレシピエントが同じ動物である）と異種（ドナーとレシピエントが異なる動物である）移植を実施した。このアプローチは、急性および慢性の両方の怪我の状況で正常に使用されています。 PNの移植片の遠位端に到達する回生の軸索は、しばしば我々はSCIの領域を周囲の瘢痕組織に関連付けられている阻害分子を分解するコンドロイチナーゼのmicroinjectionsを使用するので、脊髄に戻って拡張するために失敗する。同時に、我々は、外因性の成長と栄養分子を提供することは脊髄に長い距離が軸索の再成長を促進することを見出した。数ヶ月は、移植後に我々は脊髄損傷動物の機能の回復を評価するために、解剖学的行動および電気生理学的、さまざまなテストを実行します。この実験的なアプローチは、いくつかの脊髄損傷モデルにおいて、傷害の異なるレベルで、異なる種（マウス、ラットおよびネコ）に成功しています。重要なことは、末梢神経移植術のアプローチは、急性と慢性的に負傷ニューロンで再生を促進するのに有効です。

Protocol

顕微鏡手術のための1）の準備

1. 手術の駅は清潔で、楽器やアクセサリーの材料を設定する前に希釈漂白液で消毒する必要があります。ナショナルインスツルメンツは、手術前に1日オートクレーブと滅菌コンテナに格納されます。別の動物での手続きの間に楽器から病原体や微生物汚染物を除去するために使用されるホットビーズ滅菌器（ファイン科学のツール）をオンにします。
2. 遮熱のプラグインは、手術中、体温を維持するために使用。出血を制御するために使用する綿棒やガーゼのパッドを設定します。滅菌生理食塩水でマイクロ止血および浸漬に使用するジェルの泡の小さい（<2ミリメートル^3）ピースを準備。
3. 場所の誘導室でラットやイソフルランで麻酔をかける（5％が酸素で気化、流量2.0 L /分）。チャンバーから準備テーブルに動物を削除し、意図した手術野からの毛皮の広い面積を削る。フィールドの中央に70％イソプロピルアルコールの始まりで拭きますと同じ方法でPolyhydroxidineソリューション（Xenodine）を使用してスクラブに続いて、外側に放射。洗浄3回のこのシーケンスを繰り返します。
4. 遮熱の上に置いて動物、吸入のコーンで鼻と口をカバーし、0.2 L /分に3％、流量にイソフルラン減らす。筋肉内注射で皮下注射と鎮痛剤（ブプレノルフィン0.05 mg / kg体重）で抗生物質の適切な投与量（アンピシリン）を実現。
5. 外科医はXenodineソリューションで手をこすり、水ですすいでくださいなります。滅菌外科用ガウンは、外科医に付属となります。ハンドは滅菌タオルで乾燥し、滅菌手袋で覆われる。この手順は、このテキストで説明されている各手術のために続いている。
6. 滅菌器具をカバーする蓋は、外科医によって滅菌布の上にレイアウトされるアシスタントと楽器によって削除されます。

2）PNの切除は、変性を促進する

1. 動物は、横倒しに平行な直線を維持膝に向かって大腿骨頭から切開し、大腿骨から約3mmを行います。基本となる外側広筋を公開する、皮膚の切開と同じラインに沿って浅大腿二頭筋を通してカット。
2. 使用してはさみは膝に近い外側広筋に小さなカットを行い、大腿骨頭に向けて、これを延長することができる。坐骨神経の結合した脛骨と腓骨神経の枝が可視化されるまで再びはさみで軽く（大腿骨と平行に走る）外側広筋を分離。
3. 坐骨神経のメイントランクが識別されるまで、大腿骨頭に向けてこれらの枝をたどる。ちょうど坐骨神経の分岐の下に（これが大きな分岐である）脛骨神経の枝を周囲の結合組織（神経上膜を）慎重に分離するために微細な鉗子を使用してください。
4. 一旦単離さ脛骨神経の周りに6から0絹糸結紮をスリップして締めます。合字に吻側神経をトランセクトするマイクロはさみを使用してください。外側広筋を通して縫合線を渡すと結び目で結んでとめる。神経が7〜10日後に収穫されるときにこれは脛骨神経の切断面の容易な場所のためのラインを提供します。
5. 前の移植に脛骨神経の変性は、新鮮な神経の準備を行うよりも、軸索成長のためのより適切な環境を提供しています。
6. 6から0絹縫合糸で外側広筋を閉じます。 6から0絹縫合糸で大腿二頭筋を閉じます。ミシェルの創傷クリップで皮膚を閉じます。イソフルランの流れをオフにする、遮熱にケージを保持するには吸入のノーズコーンと場所の動物を取り外して、アラートとアクティブになるとホームケージに戻ります。

3）PNのセグメントを除去すると、

1. 上記のような意図手術野（1.3）剃るときれいに、動物を麻酔。遮熱に動物を配置。
2. 創傷クリップと、別の前の皮膚切開を削除します。この筋肉の縫合糸を通して外側広筋とカットを公開するために、表面的な筋肉の縫合糸を切断します。
3. 脛骨神経の端をカットし、神経から縫合糸を除去するために縫合線をトレースします。脛骨神経の15mmの長さから、神経上膜を細かく分析し、この遠位端を切って進むために微細な鉗子を使用してください。無菌のハンクス平衡塩溶液で神経のセグメントと浸すを削除します。
4. これは異種移植の実験の場合はEuthasolの腹腔内注射により動物を安楽死させる。これは、後述するように自己移植実験、脚の筋肉と2.6で説明したように皮膚が閉じている）と頸部の脊髄損傷のために準備動物、である場合。

4）子宮頸片側切断の傷害および移植

日1

1. 動物を麻酔、ひげをそるとINTENをきれいに上記のようDED手術野（1.3）。遮熱に動物を配置。 （1.4）上記のように抗生物質と鎮痛剤を投与する。
2. 後頭部ノッチと著名なT​​2背椎のプロセスを見つけて、切開これらの外部ランドマークとの間の完全な長さにします。表面的な僧帽筋の正中線を切断し、基盤となる頚椎菱形筋の筋肉を分離。スプレッダーを挿入することによって離れて筋肉を保つ。
3. 深い棘上の筋肉は、背側椎体プロセスC4、C5とC6からカットしてください。使用してrongeursは右辺全体と脊髄の左側の内側部を露出させるC5の部分椎弓切除を行います。脊髄の正中線のランドマークとして有名な背静脈を使用してください。
4. ピアス硬膜へのマイクロ手術用メスの刃または30ゲージの針を使用し、C5脊髄を介して切開を延長する。基本的なくも膜下および軟膜の小さな切開を加えます。
5. プルアップガラスとマイクロカニューレは、組織を分離し、その除去を容易にするために穏やかな圧力とマイクロ鉗子を用いて、脊髄の背側、右側を吸引し始める。背側から腹側へと正中線から外側髄膜に完全である2 mm長空洞を作成するために脊髄の中間および腹側の部分まで継続。
6. 止血を達成するためにキャビティ内に生理食塩水に浸したゲルフォームを置きます。
7. ハンクス溶液から末梢神経のセグメントを削除します。ゆっくりと神経のセグメントの近位3ミリメートルから神経上膜ピールと片側切断の病変のキャビティの吻側壁にこのエンドを並置する。硬膜の神経上膜を介して10から0縫合糸でセグメントを確保し、硬膜が移植片の移植端の上に閉じ縫合。
8. サンドイッチ後の時点での保護と容易な分離のためのシラスティック膜（Biobrane）の2個の間で移植。 C6、C7とT1椎骨プロセスの横に配置します。脊髄や筋肉組織に末梢神経の端を並べるしないでください。
9. 4から0縫合糸、創傷クリップとの密接な皮膚の切開と層の筋肉を閉じます。
10. それは警告とアクティブになるとホームケージに遮熱とリターンのケージを保持しているの場所の動物。

21日目

11. 上記のような意図手術野（1.3）剃るときれいに、動物を麻酔。遮熱に動物を配置し、（1.4）上記のように抗生物質と鎮痛剤を投与する。神経移植を取り巻くシラスティック膜を露出する表面的な縫合糸を切断します。細かい鉗子と春のはさみと手術野から反映を使用してシラスティック膜から神経の慎重に自由長。
12. C7椎体プロセスの右側の部分椎弓切除を行います。ピアースは、上記のように髄膜（4.4）と吸引によってC7脊髄の1 mm ^3の背側象限の病変のキャビティを準備。止血を達成してから、コンドロイチナーゼABCに浸したゲルフォームを置き換えるために生理食塩水に浸したゲルフォームを使用してください。 5分ごとに新鮮なコンドロイチナーゼ浸したゲルフォームを提供し、15分間病変部位を扱います。
13. シラスティック膜と神経移植片の外面の長さをカバーしています。 4から0縫合糸、創傷クリップで皮膚切開で表面的な筋肉を閉じます。それは警告とアクティブになるとホームケージに遮熱とリターンのケージを保持しているの場所の動物。

23日目

14. 上記のような意図手術野（1.3）剃るときれいに、動物を麻酔。遮熱に動物を配置し、（1.4）上記のように抗生物質と鎮痛剤を投与する。神経移植を取り巻くシラスティック膜を露出する表面的な縫合糸を切断します。移植を妨げるのではなく、C7のグラフトサイトを公開し、脊髄脊髄への移植の同格の遠位約1mmの右側にコンドロイチナーゼABCの1μlを微量注入するために引っ張らガラスカニューレでハミルトンシリンジを使用しないでください。
15. ゆっくりと神経のセグメントの遠位2mmから神経上膜ピールとC7の病変の空洞にこのエンドを並置する。硬膜の神経上膜を介して10から0縫合糸でセグメントを固定します。
16. 4から0縫合糸、創傷クリップで皮膚切開で表面的な筋肉を閉じます。それは警告とアクティブになるとホームケージに遮熱とリターンのケージを保持しているの場所の動物。

移植片と遠位脊髄における活動電位の5）電気生理学的記録

1. 電気的活動をPNGに再生した軸索を介して送信されているかどうかを判断するためには、まず公開し、移植片を分離する必要があります。特別な注意が物理的に移植片の損傷を防ぐために、この手順の実行中に採取し、これは移植片の配置後のシラスティック膜の使用は重要であるであるする必要があります。上記のような意図手術野（1.3）剃るときれいに、動物を麻酔。場所の目遮熱の電子の動物。
2. 皮膚を開き、表面的な筋肉を分離した後、シラスティック膜ストリップは特定され、慎重に移植の自由な解剖されています。
3. rongeursを使用すると、すぐに吻側およびPNG -脊髄の同格のサイトへの尾背側椎プロセスを削除します。このアプローチの間にあまりにも多くの移植を邪魔しないように注意してください。両方のレベルで硬膜にスリットを作る。
4. C5移植脊髄の同格のサイトに約1cm吻側は1mm程度の深さに、単一のワイヤ（プラチナイリジウムミックス）病変の同側の脊髄に刺激電極を、挿入する。バイポーラフック電極の上に移植片の中央部を慎重に持ち上げて、取り外します。 100μsecの期間で10μAのシングル刺激パルスを発生し、移植片の再分化している軸索を伝わる活動電位があるかどうかを判断します。
5. フック電極は刺激電極となると、単一のワイヤが脊髄と脊髄での活動電位を記録する試みにPNGの同格の遠位脊髄に挿入されるように接続し、配線の位置を切り替えます。
6. 実験の終わりに1時間の合計については、50Hzに100μsecの期間中、1mAまでの刺激の列車を提供しています。後で1時間、動物を安楽死させる、PNGにおける再生軸索によって活性化されたニューロンの最高財務責任者（CFO）の免疫細胞化学的検出のための、4％パラホルムアルデヒドとプロセス脊髄組織を灌流。

6）PNGと脊髄に戻って再生軸索の順行性標識に軸索を再生成するニューロンの逆行性標識法は、

1. 電気生理学的な措置でテストされていない動物の場合には、脊髄に移植し、その終了のコースに成長する軸索のソースを識別することが可能です。上記のような意図手術野（1.3）剃るときれいに、動物を麻酔。遮熱に動物を配置し、上記の6.1で説明したようにPNGを公開します。
2. その中間点で移植を切ってと移植片の切断端部から神経上膜をバック除去するマイクロはさみを使用してください。カットは、お互いから離れて終わるとパラフィルムの別のシートにそれぞれのレイアウトが反映されます。
3. PNGへの軸索に貢献ラベルのニューロンへの近位の切り口でトゥルーブルーに浸したゲルフォームの綿撒糸を置きます。脊髄への移植片の背面から伸びるラベルの軸索の遠位のカットの端にビオチン化デキストランアミン（BDA）に浸したゲルフォームの綿撒糸を置きます。
4. 3 - 4dの後に動物を安楽死させる、4％パラホルムアルデヒドとプロセスの脳とトゥルーブルーというラベルのニューロンのためのまたは標識された軸索のためのBDAの組織化学のための蛍光顕微鏡のための脊髄の組織切片を浸み込ませる。

7）胸部の完全切除の傷害および移植

これは上記の頚椎片側切断損傷モデルへの代替アプローチを提供しています。ここではより深刻な、二国間の傷害が生成され、末梢神経のセグメントは、スパンの病変空洞や損傷した脊髄の吻側および尾切り株に配置されます。

日1

1. 上記のような意図手術野（1.3）剃るときれいに、動物を麻酔。遮熱に動物を配置。 （1.4）上記のように抗生物質と鎮痛剤を投与する。
2. 最後の肋骨の挿入の時点でT12椎体レベルを識別します。脊椎のプロセスT11、T10とT9以上吻側この点から皮膚切開を行います。これら3つのプロセスに接続されている棘上の筋肉を通して浅筋膜を介してカット。
3. T10椎体プロセス（覆うT12脊髄セグメント）の完全な椎弓切除を行います。ピアス硬膜へのマイクロ手術用メスの刃または30ゲージの針を使用し、T12脊髄を介して切開を延長する。基本的なくも膜下および軟膜の小さな切開を加えます。
4. プルアップガラスとマイクロカニューレは、組織を分離し、その除去を容易にするために穏やかな圧力とマイクロ鉗子を使用して、二国間T12脊髄を吸引し始める。腹側と外側髄膜の間に完全に背側である3 mm長空洞を作成するために脊髄の中間および腹側の部分まで継続。
5. 止血を達成してから、コンドロイチナーゼABCに浸したゲルフォームを置き換えるために生理食塩水に浸したゲルフォームを使用してください。 5分ごとに新鮮なコンドロイチナーゼ浸したゲルフォームを提供し、15分間病変部位を扱います。
6. ハンクのソリューションから、末梢神経のセグメントを削除します。ゆっくりと神経のセグメントの近位4mmから神経上膜を反映しており、ぴったりと脊髄の片側の吻側および尾切り株の間に収まるように長さをカット。脊髄の反対側に並列した第一接木セグメントと並んで2番目のセグメントを、置きます。縫合硬膜が移植された移植片を介して閉じられ、小さなで硬膜をカバーシラスティック膜の一部。
7. 4から0縫合糸、創傷クリップとの密接な皮膚の切開と層の筋肉を閉じます。
8. それは警告とアクティブになるとホームケージに遮熱とリターンのケージを保持しているの場所の動物。

日3

9. 上記のような意図手術野（1.3）剃るときれいに、動物を麻酔。遮熱に動物を配置し、（1.4）上記のように抗生物質と鎮痛剤を投与する。移植部位を覆うシラスティック膜を露出する表面的な縫合糸を切断します。移植を妨げるのではなく、移植片に尾部脊髄を露出し、脊髄脊髄への移植の同格の遠位約1 mmの各側面にコンドロイチナーゼABCの1μlを微量注入するために引っ張らガラスカニューレでハミルトンシリンジを使用しないでください。
10. 4から0縫合糸、創傷クリップで皮膚切開で表面的な筋肉を閉じます。それは警告とアクティブになるとホームケージに遮熱とリターンのケージを保持しているの場所の動物。電気生理学的刺激と記録と上記のトレーサーとして5に記載されているラベル）と6）を実行します。

8）代表の結果

この手順が最適化されると末梢神経のセグメントは、密接にホスト脊髄と統合される。脊髄軸索の昇順と降順と、移植を入力して移植片の長さに相対的に平行な直線で成長し、一日あたり約1 mmの割合で移植片の先端部に拡張されます。コンドロイチナーゼは、周囲の瘢痕組織から抑制性プロテオグリカンを除去するために使用されている場合、遠位端に到達すると、軸索は、隣接する脊髄に浸透されます。機能的結合は、移植片内の軸索の刺激に対する脊髄ニューロンによる応答の電気生理学的および免疫細胞化学的検出によって決定されます。機能回復のための解剖学的な相関が戻って脊髄への神経移植を超えて拡張している軸索の数と長さをトレースすることによって評価されます。

Discussion

1. 実験の再現性のためには、脊髄損傷のレベルは、動物から動物への一貫性を保つことが重要です。したがって、椎弓切除のための適切な椎体プロセスを識別することが重要です。我々はこの研究のために片側切断または切除病変のモデルを使用しているため、病変の大きさは約または特定の脊髄路が負傷または脇に置いていたかどうか明確になります。
2. これは成長する再生軸索のためのスペースを提供するために、末梢軸索の消化を開始するので、それが軸索の内部成長をサポートするいくつかの神経栄養因子を生成するためにシュワン細胞を活性化するので、末梢神経を移植する前に事前に変性されることが必要である。
3. カットの初期配置は、脊髄組織への移植片の端部は内と外移植片の軸索の成長を最適化するために（移植片を損傷することなく）しっかりと行う必要があります。末梢神経の脊髄に移植して縫合で移植片を固定しての直接の同格は重要です。
4. 移植部位の周囲に細胞外マトリックスを変更するにはコンドロイチナーゼの使用この実験のもう一つの重要な機能です。脊髄損傷に反応して形成されたグリア瘢痕組織は、軸索の成長への構造的および化学的障壁である。瘢痕の抑制プロテオグリカン含有量のコンドロイチナーゼ消化では、移植片へと越えて再生軸索の拡張を容易にします。
5. にして末梢神経移植片の軸索成長の程度を向上させるために、この手順の可能な変更のためのいくつかの領域があります。私たちは、負傷した軸索の再生反応を促進するための移植片と宿主脊髄の間に同格のサイトへの神経栄養因子の配信を試しています。神経栄養因子の増加が要因の緩慢な放出のための現地生産やナノ粒子の注入によってを高めるためにウイルスベクターの注入によって達成することができます。我々はまた、軸索成長を促進する内因性神経栄養因子の産生を促進する上での運動の役割を検討している。上記の吸引の病変モデルに加えて我々は、子宮頸部挫傷の傷害モデルを開発し、成功した軸索の再生をサポートするために、私たちの末梢神経移植片のアプローチを適用している。
6. 我々の研究のすべてのために我々は、脊髄損傷後や脊髄、末梢神経の移植後の運動感覚行動の変化を測定するためのいくつかのアッセイを採用しています。

意義：

上記の末梢神経移植術のアプローチと我々は、成長のための適切な基層で提供される際に、成人の運動感覚ニューロンが長距離のために彼らの傷ついた軸索プロセスを再生成することを明らかにした。我々はこのアプローチは急性または遅延治療の戦略として、それが（猫）（マウス、ラット）、大小の実験動物に正常に適用できるよう実施することができることを示している。それは、再生軸索の機能活性をテストすると末梢神経移植片モデルは、脊髄の病変をブリッジ軸索のすべてに対して比較的容易なアクセスを提供することが重要です。これは他の移植のアプローチに比べて明らかな利点です。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 silk suture	ArosSurgical	T5A10N10
6-0 silk suture	McKesson	2693
Ampicillin	McKesson	483549
Antibody to cFos	Sigma-Aldrich	F7799
Biotinylated dextran Amine	Invitrogen	D7135
Buprenorphin (.3mg/ml)	McKesson	12496075701
Chondroitinase ABC	Associates of Cape Cod	100332-1A
Euthasol	Webster Veterinary	07-805-9296
Hanks Balanced Salt Solution	Cellgro	21-021-CV
Isoflurane	Henry Schein	209-1966
Michel Wound Clips	Fine Science Tools	12040-02
Neurotrace Kit	Invitrogen	N7167
True Blue	Sigma-Aldrich	T5891
Xenodine	Webster Veterinary	92201
Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools
Forced Exercise Wheel	Lafayette Instruments
TreadScan System	Clever System
Infinite Horizon Impact Device	Precision Systems and Instrumentation
Magnetic Stimulation Device	Magstim