Summary
Traumatische Verletzungen des Rückenmarks stört die Kommunikation mit dem Gehirn. Zur Wiederherstellung verloren Konnektivität nutzen wir ein peripherer Nerv Transplantat zu einem Substrat zur Regeneration von Fasern in Kombination bieten mit neurotrophen Faktoren und Matrix-modulierenden Enzyme hemmenden Moleküle zu entfernen, um Langstrecken-Wachstum zu fördern.
Abstract
Traumatische Verletzungen des Rückenmarks (SCI) führt zum Tod von Nervenzellen, Störungen der motorischen und sensorischen Nervenfaser (Axon) Wege und Störung der Kommunikation mit dem Gehirn. Eines der Ziele unserer Forschung ist es, Axonregeneration zu fördern, um die Verbindung über die Läsion Website wiederherstellen. Um dies zu erreichen haben wir ein peripherer Nerv (PN) Pfropfen Technik, bei der Segmente der Ischiasnerv entweder platziert werden direkt zwischen dem beschädigten Enden des Rückenmarks oder werden verwendet, um eine Brücke über die Läsion zu bilden. Es gibt mehrere Vorteile dieses Ansatzes im Vergleich zur Transplantation anderer Nervengewebe; regenerierenden Axone kann auf ein bestimmtes Zielgebiet gerichtet sein, die Anzahl und die Quelle der Regeneration von Axonen leicht durch Tracing-Techniken bestimmt wird, kann das Transplantat für elektrophysiologische Experimente verwendet werden, um zu messen funktionelle Erholung mit Axone im Transplantat assoziiert, und es ist möglich, eine autologe Nervenzellen benutzen, um die Möglichkeit der Abstoßung des Transplantats zu reduzieren. In unserem Labor haben wir sowohl autologe (Spender und Empfänger die gleiche Tier) und heterologe (Spender und Empfänger sind verschiedene Tiere) Transplantate mit vergleichbaren Ergebnissen durchgeführt. Dieser Ansatz wurde bereits erfolgreich bei akuten und chronischen Verletzungen Situationen verwendet. Regenerierte Axone, dass das distale Ende des PN Transplantat erreichen oft nicht reichen zurück in das Rückenmark, so verwenden wir Mikroinjektionen von Chondroitinase zu hemmenden Moleküle mit dem Narbengewebe rund um den Bereich des SCI verbundenen degradieren. Zur gleichen Zeit haben wir festgestellt, dass die Bereitstellung von exogenen Wachstums-und trophischen Molekülen fördert längere Strecke axonalen Nachwachsen in das Rückenmark. Mehrere Monate nach der Transplantation führen wir eine Vielzahl von anatomischen, Verhaltens-und elektrophysiologische Untersuchungen zur Wiederherstellung der Funktion in unserem Rückenmark verletzte Tiere zu bewerten. Dieser experimentelle Ansatz wurde bereits erfolgreich in mehreren Verletzungen des Rückenmarks Modelle verwendet, auf verschiedenen Ebenen von Verletzungen und in verschiedenen Spezies (Maus, Ratte und Katze). Wichtig ist, dass die peripheren Nerven Pfropfen Ansatz wirksam fördern die Regeneration von akuten und chronisch verletzten Neuronen.
Protocol
1) Vorbereitung für die mikroskopische Chirurgie
- Die chirurgischen Station muss sauber und hygienisch mit einer verdünnten Bleiche-Lösung vor von Instrumenten und Zubehör Materialien. Instruments wird autoklaviert 1 Tag vor der Operation werden und in einem sterilen Behälter. Schalten Sie den Hot Bead-Sterilisator (Fine Science Tools) eingesetzt, um Krankheitserreger und mikrobielle Verunreinigungen von Instrumenten zwischen Prozeduren auf verschiedene Tiere zu entfernen.
- Stecken Sie in der Wärmedämmschicht verwendet werden, um die Körpertemperatur während der Operation zu erhalten. Set aus Wattestäbchen und Gazekompressen verwendet, um Blutungen zu kontrollieren. Bereiten Sie kleine (<2mm 3) Stücke von Gel-Schaum, um für die Mikro-Hämostase und tauchen in eine sterile Kochsalzlösung verwendet werden.
- Legen Sie Ratte in einer Induktion Kammer und betäuben mit Isofluran (5% in Sauerstoff verdampft, Durchfluss 2,0 L / min). Entfernen Tier aus der Kammer zur Vorbereitung Tisch und rasieren einen weiten Bereich von Pelzen durch die bestimmungsgemäße OP-Feld. Wischen Sie mit 70% Isopropylalkohol Anfang in der Mitte des Feldes und strahlenförmig, gefolgt von Waschen mit Polyhydroxidine Solution (Xenodine) in der gleichen Weise. Wiederholen Sie diesen Vorgang der wäscht 3 mal.
- Legen Tier auf der Wärmedämmschicht, decken Nase und Mund mit Inhalation Kegel, reduzieren Isofluran bis 3% und Volumenstrom bis 0,2 L / min. Deliver geeignete Dosis Antibiotikum (Ampicillin) durch subkutane Injektion und analgetische (Buprenorphin 0,05 mg / kg) durch intramuskuläre Injektion.
- Der Chirurg wird ihre Hände mit Xenodine Lösung schrubben und mit Wasser abspülen. Eine sterile OP-Kittel wird auf der Chirurg ausgestattet werden, die Hände werden mit einem sterilen Tuch getrocknet werden und mit sterilen Handschuhen. Dieses Verfahren ist für jeden chirurgischen Eingriff in diesem Text beschrieben wird.
- Der Deckel für den sterilen Instrumenten wird von einem Assistenten entfernt werden und Instrumente werden auf einer sterilen Abdeckung verlegt werden durch den Operateur.
2) Durchtrennung der PN zu fördern Degeneration
- Mit dem Tier auf der Seite liegend zu einer geraden Linie Schnitt aus dem Kopf des Oberschenkelknochens zum Knie und hält parallel und ca. 3mm vom Oberschenkelknochen. Schnitt durch den oberflächlichen biceps femoris entlang der gleichen Linie wie der Hautschnitt, um die zugrunde liegenden Musculus vastus lateralis freizulegen.
- Mit einer Schere einen kleinen Schnitt in der vastus lateralis in der Nähe der Knie-und erweitern diese bis zum Kopf des Oberschenkelknochens. Auch mit einer Schere vorsichtig trennen vastus lateralis bis verbunden tibialis und peronaeus Zweige der Ischiasnerv visualisiert werden (parallel zur Femur).
- Trace diesen Branchen auf den Kopf des Oberschenkelknochens bis der Hauptstamm der Ischiasnerv ist identifiziert. Knapp unterhalb der Bifurkation der Ischiasnerv Verwendung feinen Pinzette vorsichtig getrennt Bindegewebe (Epineurium) rund um den Nervus tibialis Zweig (das ist der größere Ast).
- Nach der Isolierung slip einem 6-0 Seidenfaden um den Nervus tibialis und anziehen. Verwenden Sie Mikro-Schere auf den Nerv rostral der Ligatur Transekt. Pass die Naht durch den Musculus vastus lateralis und binden Sie in einen Knoten. Dies wird eine Linie zur einfachen Lokalisierung von dem abgeschnittenen Ende des Nervus tibialis, wenn der Nerv auf 7-10 Tage später geerntet werden.
- Degeneration des Nervus tibialis vor der Transplantation stellt eine Umgebung besser geeignet für das axonale Wachstum als es einen frischen Nerv Vorbereitung.
- Schließen Sie den Musculus vastus lateralis mit 6-0 Seidenfäden. Schließen Sie die Bizeps femoris mit 6-0 Seidenfäden. Schließen Sie die Haut mit Michel Wundklammern. Schalten Sie den Strom von Isofluran, entfernen Sie das Einatmen Nasenkonus und Ort Tier in Haltekäfigs auf thermische Barriere und zurück nach Hause zu Käfig, wenn es wach und aktiv ist.
3) Entfernung von PN-Segment
- Anesthetize Tier, rasieren und saubere den vorgesehenen OP-Feld, wie oben beschrieben (1,3). Legen Sie das Tier auf thermische Barriere.
- Entfernen Wundklammern und separate früheren Hautschnitt. Cut durch die Naht der oberflächlichen Muskulatur zu vastus lateralis freizulegen und schneiden durch die Naht in diesem Muskel.
- Verfolgen Sie die Naht zu Ende N.tibialis schneiden und entfernen Naht von Nerven. Verwenden feinen Pinzette Epineurium aus einer 15 mm Länge des Nervus tibialis sezieren und Schnitt durch das distale Ende. Entfernen Sie die Nerven Segment und tauchen in sterile Hanks Balanced Salt Solution.
- Wenn dies eine heterologe Transplantat Experiment euthanize das Tier durch intraperitoneale Injektion von Euthasol. Wenn dies ein autologes Transplantat Experiment, das Bein Muskeln und Haut geschlossen ist, wie in 2.6 beschrieben) und das Tier zur zervikalen Rückenmarksverletzung vorbereitet, wie unten beschrieben.
4) Cervical Hemisektion Verletzungen und Transplantation
Tag 1
- Anesthetize Tier, rasieren und reinigen Sie die intended OP-Feld, wie oben beschrieben (1,3). Legen Sie das Tier auf thermische Barriere. Verwalten Antibiotika und Analgetika wie oben (1,4).
- Suchen Sie die occipital erstklassig und die prominenten T2 dorsalen Wirbelkörper zu verarbeiten und einen Schnitt über die gesamte Länge zwischen diesen externen Landmarken. Schnitt durch die Mittellinie des oberflächlichen M. trapezius und trennen Sie die zugrunde liegenden zervikalen rhomboideus Muskeln. Keep Muskeln auseinander, indem Sie einen Spreizer.
- Die tiefe supraspinal Muskeln sollten aus dem dorsalen Wirbelfortsätzen C4, C5 und C6 geschnitten werden. Mit Rongeure eine partielle Laminektomie von C5 bis die gesamte rechte Seite und den medialen Teil der linken Seite des Rückenmarks aussetzen. Verwenden Sie den prominenten Dorsalvene als Wahrzeichen für das Rückenmark Mittellinie.
- Verwenden Sie ein Mikro-Skalpell oder einer 30-Gauge-Nadel zu durchbohren die Dura mater und verlängern die Inzision über dem C5 Rückenmark. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der zugrunde liegenden subarachnoidale und Pia mater.
- Mit einem gezapftes Mikro-Kanüle beginnen, die dorsal, rechte Seite des Rückenmarks absaugen, mit sanftem Druck und Mikro-Pinzette, um das Gewebe zu trennen und zu erleichtern seine Entfernung. Weiter durch Zwischen-und ventralen Teile des Rückenmarks zu einer 2 mm langen Hohlraum, der abgeschlossen ist von dorsal nach ventral und von der Mittellinie an den seitlichen Meningen zu schaffen.
- Legen Sie mit Kochsalzlösung getränkt Gel-Schaum in den Hohlraum der Hämostase zu erreichen.
- Entfernen Sie das Segment der peripheren Nerven aus dem Hanks-Lösung. Vorsichtig schälen Epineurium vom proximalen 3mm des Nerven-Segment und appose diesem Zweck an den rostralen Wand des Hemisektion Läsion Hohlraum. Sichern Sie das Segment mit 10-0 Faden durch das Epineurium an die Dura mater, dann Naht die Dura geschlossen über dem implantierten Ende des Transplantats.
- Sandwich das Transplantat zwischen 2 Stück Silastic Membran (Biobrane) zum Schutz und zur einfachen Isolierung zu einem späteren Zeitpunkt. Platz neben der C6, C7 und T1 Wirbelfortsätzen. Nicht appose distalen Nerven Ende des Rückenmarks oder Muskelgewebe.
- Close Muskeln in Schichten mit 4-0 Nahtmaterial und schließen Hautschnitt mit Wundklammern.
- Tier in den Käfig halten auf thermische Barriere und zurück nach Hause zu Käfig, wenn es wach und aktiv ist.
Tag 21
- Anesthetize Tier, rasieren und saubere den vorgesehenen OP-Feld, wie oben beschrieben (1,3). Legen Sie das Tier auf thermische Barriere und zu verwalten, Antibiotika und Analgetika wie oben (1,4). Schnitt durch oberflächliche Nähte an Silastic Membran umgibt den Nerv Transplantat aussetzen. Sorgfältig kostenlos die Länge der Nerv aus dem Silastic Membran mit feinen Pinzetten und Scheren Frühjahr und reflektieren aus dem OP-Feld.
- Führen Sie eine partielle Laminektomie auf der rechten Seite des C7 Wirbelkörper Prozess. Pierce den Hirnhäuten, wie oben (4,4) und durch Absaugen vorzubereiten einem 1 mm 3 dorsalen Quadranten Läsion Hohlraum in der C7 Rückenmark. Verwenden Kochsalzlösung getränkt Gel-Schaum zur Blutstillung und ersetzen Sie dann mit Gel-Schaum mit Chondroitinase ABC getränkt. Behandeln Sie die betroffenen Stellen waren 15 Minuten lang und bietet frische Chondroitinase-getränkten Gel-Schaum alle 5 Minuten.
- Decken Sie die Außenlänge des Nervs Transplantat mit Silastic Membran. Close oberflächlichen Muskeln mit 4-0 Nähten und der Hautschnitt mit Wundklammern. Tier in den Käfig halten auf thermische Barriere und zurück nach Hause zu Käfig, wenn es wach und aktiv ist.
Tag 23
- Anesthetize Tier, rasieren und saubere den vorgesehenen OP-Feld, wie oben beschrieben (1,3). Legen Sie das Tier auf thermische Barriere und zu verwalten, Antibiotika und Analgetika wie oben (1,4). Schnitt durch oberflächliche Nähte an Silastic Membran umgibt den Nerv Transplantat aussetzen. Bitte nicht stören das Transplantat, sondern setzen die C7 Transplantat Website und die Nutzung einer Hamilton-Spritze mit Kanüle gezogen Glas zu 1μl von Chondroitinase ABC in die rechte Seite des Rückenmarks ca. 1 mm distal der Anlagerung von Transplantat Rückenmark microinject.
- Vorsichtig schälen Epineurium vom distalen 2mm des Nerven-Segment und appose diesem Zweck an den C7 Läsion Hohlraum. Sichern Sie das Segment mit 10-0 Faden durch das Epineurium an die Dura mater.
- Close oberflächlichen Muskeln mit 4-0 Nähten und der Hautschnitt mit Wundklammern. Tier in den Käfig halten auf thermische Barriere und zurück nach Hause zu Käfig, wenn es wach und aktiv ist.
5) Elektrophysiologische Aufzeichnung der Aktionspotentiale in Transplantat und distalen Rückenmark
- Um festzustellen, ob die elektrische Aktivität durch Axone, die in das PNG regeneriert haben übertragen wird, müssen wir zuerst zu entlarven und zu isolieren des Transplantats. Besondere Vorsicht ist bei diesem Verfahren getroffen werden, um zu vermeiden körperlich schädigen das Transplantat und das ist, wo die Verwendung von Silastic Membran nach der Platzierung des Transplantats wichtig ist. Anesthetize Tier, rasieren und saubere den vorgesehenen OP-Feld, wie oben beschrieben (1,3). Legen the Tier auf thermische Barriere.
- Nach dem Öffnen der Haut und die Trennung oberflächlichen Muskeln sind Silastic Membranstreifen identifiziert und sorgfältig freipräpariert des Transplantats.
- Mit Rongeure entfernen Sie die dorsalen Wirbelkörper Prozess sofort rostral und kaudal der PNG-Rückenmark Apposition Seiten. Achten Sie darauf, um das Transplantat zu viel stören während dieses Ansatzes. Machen Sie einen Schlitz in der Dura mater auf beiden Ebenen.
- Ungefähr 1cm rostral des C5 graft-Rückenmark Apposition Website ein Single-Wire (Platin-Iridium-mix) Reizelektrode in das Rückenmark ipsilateral zur Läsion, bis zu einer Tiefe von ca. 1mm. Heben Sie den mittleren Teil des Transplantats auf einer bipolaren Elektrode angeschlossen. Geben Sie einzelne stimulierende Impulse von 10μA mit 100μsec Dauer und festzustellen, ob es Aktionspotentiale Reise durch Axone, die in das Transplantat regeneriert haben.
- Schalten Sie die Anschlüsse und die Position der Drähte, so dass das hakenförmige Elektrode wird der stimulierenden Elektrode und der Single-Wire ist in das Rückenmark distal der Anlagerung von PNG auf das Rückenmark und Versuch Aktionspotentiale in das Rückenmark Datensatz eingefügt.
- Am Ende des Experiments eine Bahn von 1mA Impulse für 100μsec Dauer bei 50 Hz, für insgesamt 1 Stunde. Euthanize Tieren 1 Stunde später, mit 4% Paraformaldehyd und Prozess Rückenmark für die immunzytochemische Detektion von cFos in Neuronen, die durch regenerierte Axone im PNG aktiviert wurden perfuse.
6) Retrograde Markierung von Neuronen, die regenerieren Axone in der PNG-und anterograde Kennzeichnung von Axonen, die zurück in das Rückenmark zu regenerieren
- Für Tiere, die nicht durch elektrophysiologische Messungen getestet ist es möglich, die Quelle der Axone, die in das Transplantat und der Verlauf ihrer Kündigung im Rückenmark wachsen zu identifizieren. Anesthetize Tier, rasieren und saubere den vorgesehenen OP-Feld, wie oben beschrieben (1,3). Legen Sie das Tier auf thermische Barriere und setzen die PNG als in 6.1 oben beschrieben.
- Verwenden Sie Mikro-Schere durch das Transplantat in seiner mid-point Cut and Strip zurück Epineurium aus dem abgeschnittenen Enden des Transplantats. Spiegeln die abgeschnittenen Enden von einander entfernt und liegen jeweils auf einem separaten Blatt Parafilm.
- Legen Sie eine Bäuschchen Gel-Schaum mit True Blue auf der proximalen Schnittfläche zu beschriften Neuronen, die ein Axon, die PNG beigetragen getränkt. Legen Sie eine Bäuschchen Gel-Schaum in biotinylierten Dextran Amin (BDA) am distalen Ende zu schneiden Label Axone, die aus dem Transplantat wieder in das Rückenmark zu erweitern getränkt.
- Euthanize Tiere 3-4d später, mit 4% Paraformaldehyd und Prozess Gehirn und Rückenmark Gewebeschnitten für Fluoreszenz-Mikroskopie für True Blue markierten Neuronen oder BDA Histochemie für markierte Axone perfuse.
7) Thoracic komplette Durchtrennung Verletzungen und Transplantation
Dies bietet einen alternativen Ansatz zur zervikalen Hemisektion Verletzungen Modell vor. Hier eine schwerere, bilaterale Verletzungen produziert wird und Segmente der peripheren Nerven sind in die Läsion Hohlraum Spannweite und rostral und caudal Stümpfe des verletzten Rückenmarks platziert.
Tag 1
- Anesthetize Tier, rasieren und saubere den vorgesehenen OP-Feld, wie oben beschrieben (1,3). Legen Sie das Tier auf thermische Barriere. Verwalten Antibiotika und Analgetika wie oben (1,4).
- Identifizieren T12 vertebralen Ebene Ansatzstelle des letzten Rippe. Machen Hautschnitt von diesem Punkt rostral über Wirbelfortsätzen T11, T10 und T9. Schnitt durch oberflächliche Faszie durch supraspinale Muskeln, die an diesen drei Prozessen.
- Führen Sie vollständige Laminektomie von T10 Wirbelkörper-Prozess (darüberliegenden T12 Rückenmarks-Segment). Verwenden Sie ein Mikro-Skalpell oder einer 30-Gauge-Nadel zu durchbohren die Dura mater und verlängern die Inzision über dem T12 Rückenmarks. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der zugrunde liegenden subarachnoidale und Pia mater.
- Mit einem gezapftes Mikro-Kanüle beginnen, die T12 Rückenmarks bilateral absaugen, mit sanftem Druck und Mikro-Pinzette, um das Gewebe zu trennen und zu erleichtern seine Entfernung. Weiter durch Zwischen-und ventralen Teile des Rückenmarks zu einer 3 mm langen Hohlraum, der komplette dorsal nach ventral und zwischen den seitlichen Meningen zu schaffen.
- Verwenden Kochsalzlösung getränkt Gel-Schaum zur Blutstillung und ersetzen Sie dann mit Gel-Schaum mit Chondroitinase ABC getränkt. Behandeln Sie die betroffenen Stellen waren 15 Minuten lang und bietet frische Chondroitinase-getränkten Gel-Schaum alle 5 Minuten.
- Entfernen Sie das Segment der peripheren Nerven aus dem Hank s Lösung. Gently spiegeln die Epineurium vom proximalen 4mm des Nerven-Segment und schneiden eine Länge oder zu eng zwischen den rostralen und kaudalen Stümpfe von einer Seite des Rückenmarks zu passen. Platzieren Sie ein zweites Segment neben den ersten veredelten Segment apposed auf die andere Seite des Rückenmarks. Suture die Dura geschlossen über dem implantierten Grafts und decken Dura mit einem kleinenStück Silastic Membran.
- Close Muskeln in Schichten mit 4-0 Nahtmaterial und schließen Hautschnitt mit Wundklammern.
- Tier in den Käfig halten auf thermische Barriere und zurück nach Hause zu Käfig, wenn es wach und aktiv ist.
Tag 3
- Anesthetize Tier, rasieren und saubere den vorgesehenen OP-Feld, wie oben beschrieben (1,3). Legen Sie das Tier auf thermische Barriere und zu verwalten, Antibiotika und Analgetika wie oben (1,4). Schnitt durch oberflächliche Nähte an Silastic Membran über dem Transplantat vor Ort verfügbar zu machen. Bitte nicht stören das Transplantat, sondern setzen das Rückenmark kaudal des Transplantats und die Verwendung einer Hamilton-Spritze mit Kanüle gezogen Glas zu 1μl von Chondroitinase ABC in jeder Seite des Rückenmarks ca. 1 mm distal der Anlagerung von Transplantat Rückenmark microinject.
- Close oberflächlichen Muskeln mit 4-0 Nähten und der Hautschnitt mit Wundklammern. Tier in den Käfig halten auf thermische Barriere und zurück nach Hause zu Käfig, wenn es wach und aktiv ist. Führen elektrophysiologische Stimulation und Aufnahme-und Tracer-Kennzeichnung wie in 5 beschrieben) und 6) vor.
8) repräsentative Ergebnisse
Wenn dieses Verfahren optimiert die peripheren Nerven-Segment wird eng mit dem Host-Rückenmarks integrieren. Aufsteigende und absteigende spinale Axone treten wird das Transplantat, wachsen in einer relativ geraden Linie parallel zur Länge des Transplantats und reichen bis zum distalen Ende des Transplantats mit einer Rate von ca. 1 mm pro Tag. Bei Erreichen des distalen Endes wird Axone dringen in die angrenzenden Rückenmark, wenn Chondroitinase verwendet wurde, um hemmende Proteoglykane aus den umliegenden Narbengewebe zu entfernen. Funktionelle Konnektivität wird durch elektrophysiologische und immunzytochemische Nachweis einer Reaktion Rückenmarksneuronen auf die Stimulation der Axone im Transplantat bestimmt werden. Anatomische Korrelation für die funktionelle Erholung wird durch die Verfolgung der Anzahl und Länge der Axone, die über die Nerventransplantat erweitert haben wieder in das Rückenmark zu beurteilen.
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Discussion
- Für die Reproduzierbarkeit der Experimente ist es wichtig, dass das Niveau der Verletzung des Rückenmarks im Einklang von Tier zu Tier. Daher ist es wichtig, dass die entsprechenden Wirbelkörper Verfahren zur Laminektomie identifiziert werden. Da wir mit einer halbseitiger oder Durchtrennung Läsion Modell für diese Studie sind, gibt es keine Unklarheit über die Größe der Läsion oder ob bestimmte Rückenmarksbahnen wurden verletzt oder nicht verschont.
- Es ist notwendig, dass die peripheren Nerven vor der Transplantation vor degeneriert werden, da dies initiiert Verdauung der peripheren Axone Platz für regenerierenden Axonen zu expandieren und zu, und weil es Schwann-Zellen aktiviert, mehrere neurotrophen Faktoren, die das Einwachsen von Axonen Unterstützung zu produzieren.
- Anfängliche Platzierung der abgeschnittenen Enden des Transplantats zu Rückenmark sollten fest gemacht werden (ohne Beschädigung des Transplantats), um Axon-Wachstum in den und aus dem Transplantat zu optimieren. Direkte Anlagerung der peripheren Nerven Transplantat auf das Rückenmark und die Sicherung des Transplantats mit Nähten ist kritisch.
- Verwendung von Chondroitinase an die extrazelluläre Matrix um das Transplantat-Website ändern ist ein weiteres entscheidendes Merkmal dieser Experimente. Gliazellen Narbengewebe in Reaktion auf Verletzungen des Rückenmarks gebildet ist eine strukturelle und chemische Barriere gegen das axonale Wachstum. Chondroitinase Verdauung des hemmenden Proteoglykan Inhalt der Narbe erleichtert die Erweiterung des regenerierenden Axone in und außerhalb des Transplantats.
- Es gibt verschiedene Bereiche für mögliche Änderung dieses Verfahrens, um das Ausmaß des axonalen Wachstums in und aus der peripheren Nerven Transplantats zu verbessern. Wir sind mit der Lieferung von neurotrophen Faktoren an den Ort der Anlagerung zwischen Transplantat und Wirt des Rückenmarks, die regenerative Antwort von verletzten Axonen fördern experimentieren. Eine Erhöhung der neurotrophen Faktoren kann durch Injektion von viralen Vektoren erreicht werden, um die lokale Produktion oder durch Injektion von Nanopartikeln für eine allmähliche Freisetzung von Faktoren zu erhöhen. Wir untersuchen die Rolle der Übung in der Förderung der Produktion von körpereigenen neurotrophen Faktoren auf das axonale Wachstum zu erleichtern. Neben dem Streben Läsion oben beschriebenen Modelle haben wir eine HWS Prellung Verletzungen Modell entwickelt und erfolgreich unsere peripheren Nerven Transplantat Ansatz auf axonale Regeneration zu unterstützen.
- Für alle unsere Studien beschäftigen wir mehrere Tests, um Änderungen in motorischen und sensorischen Verhalten nach Verletzungen des Rückenmarks und nach intraspinale Transplantation von peripheren Nerven zu messen.
Bedeutung:
Mit der peripheren Nerven Pfropfen Ansatz oben beschrieben wir haben gezeigt, dass adulte motorischen und sensorischen Neuronen ihre verletzten Axonen Prozess für lange Strecken zu regenerieren, wenn sie mit einem geeigneten Substrat für das Wachstum zur Verfügung gestellt. Wir haben gezeigt, dass dieser Ansatz kann als eine akute oder verzögerte Behandlungsstrategie und dass sie erfolgreich zu klein (Maus, Ratte) und große (cat) Versuchstieren angewendet werden durchgeführt werden. Es ist wichtig, dass die funktionelle Aktivität von regenerierenden Axonen getestet und die peripheren Nerven graft-Modell bietet relativ einfachen Zugang zu allen von den Axonen Überbrückung einer Querschnittlähmung. Dies ist ein klarer Vorteil gegenüber anderen Ansätzen der Transplantation.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH / NINDS Grants NS26380 und NS55976, der Christopher and Dana Reeve Foundation und der Daniel Heumann Fund for Spinal Cord Research gefördert. Die Drexel University College of Medicine Spinal Cord Research Center bietet Unterstützung für Core Facilities verwendet, um dieses Werk zu vollenden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 silk suture | ArosSurgical | T5A10N10 | |
| 6-0 silk suture | McKesson | 2693 | |
| Ampicillin | McKesson | 483549 | |
| Antibody to cFos | Sigma-Aldrich | F7799 | |
| Biotinylated dextran Amine | Invitrogen | D7135 | |
| Buprenorphin (.3mg/ml) | McKesson | 12496075701 | |
| Chondroitinase ABC | Associates of Cape Cod | 100332-1A | |
| Euthasol | Webster Veterinary | 07-805-9296 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Cellgro | 21-021-CV | |
| Isoflurane | Henry Schein | 209-1966 | |
| Michel Wound Clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
| Neurotrace Kit | Invitrogen | N7167 | |
| True Blue | Sigma-Aldrich | T5891 | |
| Xenodine | Webster Veterinary | 92201 | |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | ||
| Forced Exercise Wheel | Lafayette Instruments | ||
| TreadScan System | Clever System | ||
| Infinite Horizon Impact Device | Precision Systems and Instrumentation | ||
| Magnetic Stimulation Device | Magstim |
References
- Houle, J. D. Demonstration of the potential for chronically injured neurons to regenerate axons into intraspinal peripheral nerve grafts. Exp. Neurol. 113, 1-9 (1991).
- Ye, J. H., Houle, J. D. Treatment of the chronically injured spinal cord with neurotrophic factors can promote axonal regeneration from supraspinal neurons. Exp. Neurol. 143, 70-81 (1997).
- Houle, J. D., Tom, V., Mayes, D., Wagoner, G., Phillips, N., Silver, J. Combining an autologous peripheral nerve bridge and matrix modification by chondroitinase allows robust functional regeneration across a hemisection lesion of the adult rat spinal cord. J. Neurosci. 26, 7405-7415 (2006).
- Tom, V., Houle, J. D. Intraspinal microinjection of chondroitinase ABC following injury promotes axonal regeneration out of a peripheral nerve graft. Exp. Neurol. 211, 315-319 (2008).
