Summary
यहाँ हम murine रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (RGCs) में जीन की अभिव्यक्ति जोड़ तोड़ करने के लिए दो तकनीकों को प्रस्तुत
Abstract
रेटिना और इसकी एकमात्र उत्पादन के न्यूरॉन, रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल (RGC), जिसमें सेल भेदभाव, अक्षतंतु मार्गदर्शन, retinotopic संगठन और synapse [1] गठन जैसे जैविक सवालों की जांच करने के लिए एक शानदार मॉडल शामिल हैं. एक दोष करने के लिए कुशलतापूर्वक और मज़बूती vivo में RGCs में विशेष रूप से अन्यथा सुलभ murine दृश्य रास्ते में जीन की अभिव्यक्ति, हेरफेर करने में असमर्थता है. ट्रांसजेनिक चूहों जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इस दृष्टिकोण अक्सर महंगा है, समय लगता है, और अवांछित दुष्प्रभावों का उत्पादन कर सकते हैं. लड़की, ओवो electroporation में रेटिना और RGC विकास की जांच के लिए RGCs में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हालांकि इसी तरह electroporation तकनीक नवजात माउस पिल्ले में विकसित किया गया है [2], वयस्क [3] चूहों, और भ्रूण murine retinae इन विट्रो में [4], इन रणनीतियों में से कोई भी RGC और vivo में विकास अक्षतंतु अनुमानों का पूरा लक्षण वर्णन की अनुमति. यह अंत करने के लिए, हम electroporation की दो अनुप्रयोगों, एक utero और अन्य पूर्व vivo में विकसित किया है, विशेष रूप से भ्रूण murine [5 6] RGCs लक्ष्य.
Utero रेटिना electroporation में के साथ, हम misexpress या RGCs में विशिष्ट जीन downregulate कर सकते हैं और vivo में दृश्य रास्ते के माध्यम से अपने अक्षतंतु अनुमानों का पालन, मार्गदर्शन निर्णय ऑप्टिक chiasm जैसे मध्यवर्ती लक्ष्य, या लक्ष्य क्षेत्रों, जैसे परीक्षा की अनुमति पार्श्व geniculate नाभिक. एक अन्यथा जंगली प्रकार पृष्ठभूमि में RGCs के एक सबसेट में जीन की अभिव्यक्ति perturbing रेटिना मार्ग भर में जीन समारोह की समझ की सुविधा. इसके अतिरिक्त, हम इन विट्रो में RGC अक्षतंतु विकास का विश्लेषण करने के लिए एक साथी की तकनीक विकसित की है. हम भ्रूण सिर पूर्व vivo electroporate, इकट्ठा और पूरे रेटिना सेते हैं, तो इन retinae कई दिनों से explants बाद तैयार. रेटिना explants इन विट्रो assays में की एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता है क्रम में करने के लिए मार्गदर्शन cues या अन्य कारकों के लिए electroporated RGC axons की प्रतिक्रिया की जांच. संक्षेप में, तकनीक के इस सेट हमारे misexpress या RGCs में जीन downregulate और बहुत RGC विकास और अक्षतंतु अनुमानों की जांच के अध्ययन में सहायता करनी चाहिए करने की क्षमता को बढ़ाता है.
Protocol
भाग 1: utero और पूर्व vivo रेटिना electroporations में स्थापना
1. Utero और पूर्व vivo रेटिना electroporations में दोनों के लिए
- एक इलेक्ट्रोड खींचने का प्रयोग ठीक - इत्तला दे दी micropipettes तैयार करने और टिप (या बेवल टिप) को तोड़ने के लिए एक angled बिंदु बना.
- वांछित सांद्रता डीएनए समाधान तैयार है और फास्ट ग्रीन डाई (0.05%) की एक छोटी राशि जोड़ इंजेक्शन कल्पना. मैं 5 μl माँ प्रति डीएनए के लिए utero रेटिना electroporations में और 1 पूर्व vivo रेटिना electroporations के लिए भ्रूण सिर प्रति μl डीएनए समाधान समाधान की सिफारिश. GFP अभिव्यक्ति (या अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन) का निर्माण ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स कल्पना शामिल.
- आटोक्लेव के माध्यम से शल्य चिकित्सा उपकरणों जीवाणुरहित.
- 100 μg / मिलीलीटर ketamine के 1.0:0.2:4.6 बड़ा अनुपात: 100 / μg मिलीलीटर xylazine: खारा निम्नलिखित अनुपात (प्रत्येक गर्भवती महिला के लिए ~ 0.2 मिलीलीटर) के साथ ketamine xylazine संवेदनाहारी मिश्रण तैयार करें. अन्य anesthetics इस्तेमाल किया जा सकता है.
2. केवल utero रेटिना electroporations में लिए
- हीटिंग पैड पर मुड़ें और यह एक डायपर पैड के साथ कवर.
- फॉस्फेट बफर (पीबीएस) खारा और हीटिंग पैड पर गर्म में एंटीबायोटिक antimycotic समाधान (1:100) तैयार करें. प्रत्येक बांध के लिए ~ 2 मिलीलीटर तैयार.
- गर्म पानी से स्नान में बाँझ फ़िल्टर पीबीएस रखें.
3. केवल पूर्व vivo रेटिना electroporations के लिए
- 95% ऑक्सीजन / 5% ≥ 2 घंटे के लिए कार्बन डाइऑक्साइड के साथ बुलबुला DMEM/F12 के 25 मिलीलीटर: oxygenated रेटिना ऊष्मायन के लिए सीरम मुक्त (SFM) मध्यम तैयार करें. 25 मिलीलीटर oxygenated मध्यम करने के लिए, छ 0.25 गोजातीय सीरम albumin (BSA), 250 μl इसके पूरक और 50 μl समाधान पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें. समाधान का मिश्रण BSA भंग, तो बाँझ फिल्टर समाधान. यह समाधान प्रत्येक electroporation प्रयोग के लिए नए सिरे से बनाया जाना चाहिए.
- SFM 0.4 +% methylcellulose मध्यम आटोक्लेव हलचल चुंबक के साथ एक 150 मिलीलीटर की बोतल में 0.20 methylcellulose के छ: रेटिना explant ऊष्मायन के लिए तैयार है. SFM (जैसा कि ऊपर बुदबुदाती के बिना) का 50 मिलीलीटर की तैयारी और autoclaved methylcellulose बोतल के लिए जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात इस समाधान का मिश्रण. बाँझ इस समाधान में निम्नलिखित दिन और 4 बजे दुकान फिल्टर ° सी, इस समाधान ~ 1 महीने के लिए रखा जा सकता है.
- रेटिना explant कटाई (भाग 5) के दिन में, रेटिना explant चढ़ाना के लिए व्यंजन तैयार: ≥ 2 घंटे के लिए पाली एल ओर्निथिन के 250 μl के साथ कोट गिलास नीचे संस्कृति व्यंजन 37 में डिग्री सेल्सियस (वैकल्पिक रूप से, बर्तन पाली - एल - ओर्निथिन के साथ पिछले दिन लेपित कर सकते हैं और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात incubated) धो व्यंजन Pbs, तो DMEM/F12 के लिए 200 10 μg / मिलीलीटर laminin के μl के साथ कोट व्यंजन के साथ कई बार ≥ 37 में 2 घंटे डिग्री सेल्सियस व्यंजन पीबीएस के साथ 37 पर कई बार धो डिग्री सेल्सियस और PBS पर छोड़ जब तक explants चढ़ाना के लिए तैयार हैं.
- सीमा assays के लिए, पाली ओर्निथिन के साथ कोट व्यंजन इसके बाद के संस्करण के रूप में, तो एक फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ साथ ब्याज की प्रोटीन के साथ पकवान की कोट आधा पर 2 घंटे के लिए सीमा (जैसे Alexa 555 Fluor BSA, 1:800 संयुग्मित) कल्पना करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के साथ धो, तो laminin जोड़ने के रूप में ऊपर वर्णित है.
पार्ट 2A: utero रेटिना electroporation इंजेक्शन और vivo में E14.5 murine retinae electroporating में डीएनए
- E13.5 - E14.5 चरण बांध में संवेदनाहारी मिश्रण intraperitoneal (आईपी) के 0.15 मिलीलीटर इंजेक्षन. यह 3-7 मिनट ले जब तक माँ संज्ञाहरण के एक शल्य चिकित्सा विमान तक पहुँच गया है चाहिए. एक पूरी तरह से anesthetized माउस hindpaw के pinching के लिए जवाब नहीं चाहिए.
- इस समय के दौरान, parafilm और pipet का एक छोटा सा टुकड़ा काट ~ parafilm पर 5 उल डीएनए समाधान के. एक 90 ° डिग्री के कोण पर सवार बेंड (धातु के तार) और यह एक खींच micropippette में सम्मिलित. सवार का प्रयोग, micropipette (एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग इस प्रक्रिया में सहायता कर सकते हैं) में डीएनए समाधान aspirate.
- एक बार माँ संज्ञाहरण के एक शल्य चिकित्सा विमान तक पहुँच गया है, एक ~ 2 इंच माँ के पेट के क्षेत्र में एक बिजली के रेजर का उपयोग करने के लिए दाढ़ी, तो हीटिंग पैड पर उसे पृष्ठीय पक्ष नीचे जगह है. तैयारी एक शराब पैड के साथ पोंछते द्वारा मुंडा क्षेत्र आयोडीन पैड कम से कम दो बार के द्वारा पीछा किया. नेत्र डॉक्टर मरहम की प्रत्येक आंख आँखों के corneal ulceration रोकने जबकि माँ सामान्य संज्ञाहरण के तहत है पर एक बूंद रखें.
- संदंश के साथ, त्वचा समझ और कैंची का उपयोग midline (~ इंच एक लंबे) के साथ त्वचा और पेट की मांसपेशियों के माध्यम से एक ऊर्ध्वाधर चीरा, peritoneum उजागर. संदंश के साथ पेरिटोनियम लिफ्ट और इस झिल्ली के माध्यम से एक समान ऊर्ध्वाधर चीरा बनाने के लिए उदर गुहा (चित्रा 1) का पर्दाफाश . फिर धुंध पैड के साथ शल्य चिकित्सा क्षेत्र में कपड़ा से संपर्क करें और बालों से दूषित किया जा रहा से पेट सामग्री को रोकने केजानवर के.
- संदंश के साथ त्वचा और पेरिटोनियम वापस खींचो और चीरा के माध्यम से एक भ्रूण निकालने (सबसे सुलभ भ्रूण चुन) विदारक रंग का उपयोग करें. 2 भ्रूण के बीच रंग प्लेस और धीरे उदर गुहा के बाहर भ्रूण चेन खींच. तुम बाहर अपनी उंगलियों के साथ भ्रूण चेन खींच सकते हैं.
* इस आगे बिंदु से, भ्रूण बाँझ पीबीएस के साथ hydrated रखने * - हीटिंग पैड पर माँ रखें, उसे विदारक माइक्रोस्कोप और मालिश इतना है कि रेटिना का सामना करना पड़ रहा है एक भ्रूण के तहत जगह है. मैं या तो सबसे औसत दर्जे का या पार्श्व भ्रूण के साथ शुरू करने की सिफारिश, यह आसान रखने के लिए ट्रैक जो की भ्रूण electroporated थे.
- अपने प्रमुख हाथ में micropipette ले लो और अपने दूसरे हाथ से भ्रूण स्थिर. Micropipette के साथ, पियर्स गर्भाशय की दीवार और amniotic थैली के माध्यम से रेटिना. Micropipette की कुशाग्रता पर निर्भर करता है, यह गर्भाशय की दीवार घुसना करने के लिए दबाव के एक निष्पक्ष राशि ले सकता है, लेकिन एक बार के माध्यम से micropipette भ्रूण और आदर्श रेटिना में प्रवेश करेंगे. यह मुश्किल हो सकता है नियंत्रण और micropipette की गहराई गेज के रूप में यह भ्रूण में प्रवेश करती है कर सकते हैं. एक बार यह झिल्ली छेदा प्रवेश द्वार छेद विस्तार, amniotic द्रव और भ्रूण मौत के रिसाव में जिसके परिणामस्वरूप को रोकने micropipette आंदोलन की राशि न्यूनतम. भेदी गर्भाशय की दीवार में रक्त वाहिकाओं से बचें, के रूप में यह खून बह रहा है और भ्रूण मौत में परिणाम होगा.
- एक बार जब आप विश्वास है कि micropipette रेटिना में प्रवेश किया है कर रहे हैं, आप रेटिना में डीएनए समाधान निष्कासित करने के लिए तैयार हैं. सवार धीरे दबाना और एक साथ micropipette वापस लेने, सुनिश्चित करना है कि डीएनए micropipette के पथ भर में इंजेक्शन है, के रूप में micropipette अक्सर रेटिना को गहरे प्रवेश. यदि आप रेटिना में हैं, बाहरी रेटिना परत और रेटिना वर्णक उपकला (RPE) के बीच extraretinal अंतरिक्ष में निष्कासित μl 0.5 (1 micropipette पर μl टिकटिक के निशान के द्वारा मापा जा सकता है है). आप हरी डाई रेटिना और लीक amniotic द्रव (चित्रा 1) में बाहर भरने का पालन करना चाहिए.
- electroporation paddles सर्जरी के दौरान एक पीबीएस भरा पेट्री डिश में रखा जाना चाहिए. धीरे भ्रूण सिर के पक्षों पर इंजेक्शन आंख के रूप में एक ही पक्ष पर सकारात्मक चप्पू (+) के साथ paddles जगह है . सिर को स्थिर करने के लिए दबाव के एक उदार राशि लागू करें, लेकिन प्रेस भी मुश्किल नहीं है, के रूप में इस एमनियोटिक और भ्रूण मौत में परिणाम थैली पॉप जाएगा. जब इलेक्ट्रोड जगह में हैं, 60 हर्ट्ज की एक आवृत्ति पर 5 40 वी, 50 एमएस वर्ग दालों उद्धार. यह असामान्य के लिए माँ त्वचा और मांसपेशियों को वर्तमान से बचने के लिए कारण चिकोटी नहीं है.
- दोहराएँ प्रत्येक भ्रूण के लिए 7-9 चरणों का इंजेक्शन और electroporated. मैं आमतौर पर माँ प्रति 4-8 भ्रूण, डीएनए की मात्रा पर निर्भर करता है, भ्रूण की संख्या, माँ की हालत, और संवेदनाहारी के तहत समय की राशि electroporate. वैकल्पिक रूप से, कई भ्रूण और इंजेक्शन जा सकता है तो electroporated, के रूप में करने के लिए इंजेक्शन और प्रत्येक भ्रूण अलग electroporating विरोध.
- भ्रूण electroporating के बाद, संदंश और रंग का उपयोग करने के लिए उदर गुहा में भ्रूण श्रृंखला वापस जगह. उदर गुहा में ~ एंटीबायोटिक antimycotic समाधान के 2 मिलीलीटर डालो.
- पेरिटोनियम सीवन, चीरा के पूर्वकाल भाग पर एक डबल गाँठ साथ शुरू और एक साधारण सतत सीवन चीरा के पीछे भाग पैटर्न के साथ आगे बढ़ना hemostat और संदंश का प्रयोग करें. अंतिम पाश उपयोग के लिए रवाना सिवनी और ट्रिम अतिरिक्त सीवन टाई.
- प्रधान चीरा बंद करने के लिए, कुंद संदंश के साथ चीरा के पूर्वकाल भाग में त्वचा लिफ्ट पेरिटोनियम से त्वचा को अलग करने के लिए सावधान किया जा रहा है. त्वचा ऊन बेचनेवाला के दांत के आसपास प्लेस और ऊन बेचनेवाला दबाना. स्टैपल चीरा पीछे अंत में, जो आमतौर पर 5-7 स्टेपल की आवश्यकता के लिए बंद कर दिया जारी रखें. एक शराब पैड के साथ स्टेपल के आसपास घाव को साफ कर लें.
- चलो माँ हीटिंग पैड (आमतौर पर 15-90 मिनट के लिए उसे जगाने के लिए लिए समय के बीच लेता) पर ठीक करने के लिए और जब वह के लिए रोल करने के लिए शुरू होता है, एक नए पिंजरे पेट पक्ष में उसे जगह.
- दर्द और परेशानी को कम करने के लिए, माताओं जागृति पर buprenorphine (0.05-0.1 मिलीग्राम / किलो सुप्रीम कोर्ट) प्राप्त करते हैं, और बाद में समय अंक अगर असुविधा जारी है. निर्जलीकरण को रोकने के लिए, 1.0 मिलीलीटर खारा subcutaneously (सुप्रीम कोर्ट) ~ 2-4 घंटे के बाद सर्जरी, और फिर अगर शाम और अगले दिन अगर जरूरत के साथ माँ इंजेक्षन. 24 घंटे के बाद सर्जरी, माँ सामान्य व्यवहार पाने और पीने और नियमित रूप से खाने चाहिए.
Utero electroporated रेटिना की रेटिना electroporation रिट्रीवल में E18.5: भाग 2B
- पीबीएस में 4% (पीएफए) paraformaldehyde तैयार ~ भ्रूण 5 मिलीलीटर प्रति बना. Perfusions जलसेक गुरुत्वाकर्षण आधारित प्रणाली या एक सिरिंज पंप के साथ किया जा सकता है. (वैकल्पिक रूप से, E18.5 सिर सिर्फ 4% रातोंरात पीएफए में डूब जा सकता है.)
- साथ माँ इंजेक्षनचतनाशून्य करनेवाली औषधि के 0.2 मिलीलीटर आईपी मिश्रण है और यह सुनिश्चित करना है कि वह संवेदनाहारी के तहत पूरी तरह से है. त्वचा और स्टेपल नीचे पेरिटोनियम उदर गुहा और गर्भाशय सींग का पर्दाफाश कटौती एक कैंची का प्रयोग करें.
- एक electroporated भ्रूण निकालें और यह ventral पक्ष पिन अप. Ribcage के पेट की त्वचा, peritoneum, डायाफ्राम, और पार्श्व भाग के माध्यम से कट करने के लिए दिल बेनकाब. पियर्स तितली छिड़काव सेटअप करने के लिए संलग्न सुई के साथ बाएं वेंट्रिकल, और एक microscissors के साथ सही atrium में कटौती. छिड़काव आरंभ और पीएफए ~ 60 सेकंड के लिए प्रवाह करने की अनुमति देते हैं, रक्त सही atrium से बाहर निकलें और भ्रूण पीला हो अगर छिड़काव सफल है चाहिए चाहिए. भ्रूण सिर काटना और 4% पीएफए में 15 मिलीलीटर शंक्वाकार शीशी में सिर इकट्ठा. सभी electroporated भ्रूण के लिए इस कार्यविधि को दोहराएँ. 4% 4 बजे रात में पीएफए ° सी में सिर रखें, और तब कई दिनों के लिए पीबीएस में धो. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था जब सभी भ्रूण एकत्र कर रहे हैं के माध्यम से माँ euthanize.
रेटिना हटाना
- पीबीएस washes के बाद, सामना करना पड़ रहा रेटिना के साथ एक विच्छेदन डिश में सिर पिन और पीबीएस में विसर्जित. RPE प्रकट रेटिना भर से त्वचा निकालें. एक सुई 26G1 / 2 का प्रयोग, पंचर जंक्शन लेंस RPE वेंट्रल रेटिना. इस छेद में एक microscissors के एक किनारे डालें और ऑप्टिक डिस्क वेंट्रल रेटिना के माध्यम से एक ऊर्ध्वाधर चीरा बनाते हैं. यह आप पूरबी रेटिना की अनुमति जब आप इसे हटा देगा.
- ठीक बिंदु संदंश के साथ RPE निकालें. एक संदंश के साथ उदर चीरा RPE पकड़ो और RPE छील रेटिना से दूर अन्य संदंश जंक्शन RPE लेंस जहां RPE मजबूती से जुड़ा हुआ है पर विशेष रूप से, का उपयोग करें. RPE हटाने के बाद, ठीक संदंश के साथ लेंस समझ और लेंस को दूर ऊपर और दूर खींच. ऑप्टिक तंत्रिका सिर के चारों ओर संदंश रखकर रेटिना निकालें और बंद रेटिना चुटकी. रेटिना स्थानांतरण पीबीएस भरा रखने, अच्छी तरह से ट्रैक जो की retinae आया से जो सिर.
- Contralateral रेटिना के लिए 4-5 चरण दोहराएँ, और अन्य सभी electroporated भ्रूण के लिए. गैर इंजेक्शन रेटिना immunostaining के लिए एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है.
- एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन विदारक प्रयोग GFP + कोशिकाओं (हरा retinae) के लिए सभी retinae स्कैन. सभी GFP + retinae के लिए, electroporation इस भ्रूण में सफल रहा था, और इन retinae और इसी मस्तिष्क (दृश्य प्रणाली के साथ बरकरार) आगे के विश्लेषण (यानी सेक्शनिंग और immunostaining) (चित्रा 1) के लिए संसाधित किया जा सकता है.
भाग 3a: पूर्व vivo रेटिना electroporation इंजेक्शन और इन विट्रो में E14.5 murine retinae में डीएनए electroporating
- चतनाशून्य करनेवाली औषधि मिश्रण की 0.2 मिलीलीटर के साथ एक E13.5 E14.5 चरण माँ anesthetize और यह सुनिश्चित करना है कि वह संवेदनाहारी के तहत पूरी तरह से है. कैंची का प्रयोग करें त्वचा और पेट भ्रूण बेनकाब गुहा के माध्यम से कटौती. संदंश के साथ भ्रूण श्रृंखला लिफ्ट और संयोजी ऊतक के माध्यम से कटौती करने के लिए पूरी तरह से माँ से पूरे भ्रूण श्रृंखला निकालने के लिए. भ्रूण श्रृंखला DMEM/F12 के साथ बर्फ पर एक पेट्री डिश में रखें. गर्भाशय ग्रीवा के अव्यवस्था के माध्यम से माँ euthanize.
- एक microscissors के साथ पूरे गर्भाशय की दीवार के माध्यम से कट. फिर संदंश का उपयोग करने के लिए और नाल बंद एमनियोटिक थैली चुटकी से प्रत्येक भ्रूण को निकालने के. प्रत्येक भ्रूण सिर काटना और DMEM/F12 के साथ बर्फ पर एक और पेट्री डिश में सिर इकट्ठा.
- मुँह pipet या गोताख़ोर pipet का प्रयोग, डीएनए समाधान के वांछित राशि के साथ micropipette भरने के लिए (भाग 1 देखें).
- इस प्रोटोकॉल, डीएनए परिधीय पृष्ठीय रेटिना में अंतःक्षिप्त किया जाएगा. एक डीएनए इंजेक्शन साइट और इलेक्ट्रोड paddles की स्थिति का समायोजन करके अन्य रेटिनल क्षेत्रों को लक्षित कर सकते हैं.
- पीबीएस के साथ विदारक पकवान स्थानांतरण एक सिर और सिर पृष्ठीय पक्ष पिन अप. संदंश का प्रयोग करें रेटिना ऊपर त्वचा को हटा दें.
- Micropipette होल्डिंग ~ 10 ° क्षैतिज स्थिति (अनिवार्य रूप से पृष्ठीय रेटिना की वक्रता के समानांतर) से, RPE के माध्यम से micropipette धक्का इतना है कि टिप RPE और बाहरी रेटिना परत के बीच है. इस अंतरिक्ष में ~ 0.1-0.4 μl डीएनए समाधान निष्कासित, हरी तरल पूरे स्थान को भरने और RPE में छेद के माध्यम से बाहर लीक नमूदार किया जाना चाहिए. Contralateral रेटिना के लिए इंजेक्शन दोहराएँ.
- ध्यान लेकिन जल्दी पिंस हटाने और (रखने सिर पीबीएस में डूबे) के सिर के चारों ओर जगह इलेक्ट्रोड paddles के सिर के ventral पक्ष पर सकारात्मक चप्पू (+) के साथ. 4 40 वी, 60 हर्ट्ज पर 50 एमएस दालों, तो सिर को पीछे बर्फ (चित्रा 2) पर एक डिश में जगह DMEM/F12 साथ वितरित करें.
- सभी सिर के लिए और सभी डीएनए समाधान के लिए चरण 5-7 दोहराएँ. Electroporations पूरा करने के बाद, 4 अच्छी तरह से एक डिश ~ oxygenated SFM समाधान के 1.5 मिलीलीटर जोड़ने और बर्फ पर रख (प्रत्येक अलग डीएनए इंजेक्शन समाधान के लिए अच्छी तरह से).
- DMEM/F12 साथ विदारक पकवान एक रेटिना ऊपर का सामना करना पड़ के साथ एक सिर, स्थानांतरण. उदर रेटिना में (या पक्ष विपरीत लक्ष्य क्षेत्र), ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए चुटकीऔर RPE में एक छेद आंसू. इस छेद के माध्यम से रेटिना से दूर RPE छील संदंश के एक छोर सम्मिलित जंक्शन लेंस-रेटिना पर विशेष रूप से,. कटौती या रेटिना क्षति क्योंकि यह रेटिना कारण ऊष्मायन के दौरान खुद पर गिर जाएगा मत करो. RPE हटाने के बाद, संदंश का उपयोग रेटिना के आधार पर बन्द रखो ऑप्टिक तंत्रिका रेटिना (लेंस बरकरार छोड़) पॉप. Oxygenated SFM retinae स्थानांतरण. सिर पलटें और contralateral आंख के लिए दोहराएँ.
- सभी electroporated सिर के लिए 9 कदम को पूरा करें. 37 ° C पर 40-48 घंटे के लिए oxygenated SFM में रेटिना सेते हैं.
पूर्व vivo रेटिना electroporation फसल काटने वाले और GFP की चढ़ाना + रेटिना explants (2 दिनों के बाद electroporation): भाग 3b
- से अच्छी तरह से oxygenated SFM के DMEM/F12 के साथ एक पेट्री डिश ढक्कन में सभी retinae स्थानांतरण. एक रेटिना का चयन करें और फ्लोरोसेंट विदारक गुंजाइश का उपयोग करने के लिए रेटिना के GFP + भाग (हरा) कल्पना.
- एक microscalpel और संदंश का प्रयोग काटना, और गैर - GFP रेटिना के + भाग इतना है कि केवल एक + रेटिना के GFP हिस्सा रहता है त्यागें. यह उपयोगी है लगातार विच्छेदन भर फ्लोरोसेंट और नियमित रूप से प्रकाश के बीच स्विच करने के लिए विशेष रूप से + GFP रेटिना का चयन करें. + GFP रेटिना DMEM/F12 के साथ एक अच्छी तरह से करने के लिए स्थानांतरण.
- एक अच्छी तरह से सभी रेटिना के लिए चरण 2 दोहराएँ. प्रत्येक डीएनए हालत (प्रत्येक अलग अच्छी तरह से) के लिए, एक नया पेट्री डिश और DMEM/F12 मध्यम का उपयोग करें.
- इन GFP + retinae अब चढ़ाना के लिए छोटे रेटिना explants में dissected होना चाहिए. विदारक गुंजाइश के तहत, छोटे explants में microscalpel साथ GFP + रेटिना का बड़ा टुकड़ा काट. Explants आयताकार होना चाहिए, ~ लंबाई और चौड़ाई में 200-300 सुक्ष्ममापी. DMEM/F12 के साथ एक अच्छी तरह से में सभी explants लीजिए. एक + रेटिना के GFP हिस्सा ~ 4-10 + GFP रेटिना ऊतक आकार पर निर्भर करता है explants उत्पादन चाहिए. सभी + GFP रेटिना क्षेत्रों है कि काटा गया के लिए इस चरण को दोहराएँ.
- सभी + GFP रेटिना explants तैयारी करने के बाद, SFM के 250 μl जोड़ + 0.4% methylcellulose laminin लेपित संस्कृति व्यंजन (पार्ट 1) (4 डिग्री सेल्सियस पर रखा है) स्थानांतरण 08/04 + GFP संस्कृति डिश और संदंश का उपयोग करने के लिए केंद्र और पकवान के किनारे के बीच आधे रास्ते स्थित explants के साथ एक बहुभुज में धीरे explants व्यवस्था explants.
- निर्धारित जो explant के पक्ष RGC परत है. कभी कभी RPE क्रिस्टल बाहरी रेटिना परत से जुड़ा है, यह दर्शाता है कि विपरीत दिशा RGC परत है रहते हैं. इसके अलावा, RGC पक्ष आमतौर पर कुछ सेलुलर मलबे कि उचित explant ओरिएंटेशन में सहायता कर सकते है.
- RGC नीचे परत के साथ, संदंश का उपयोग मजबूती explant के केंद्र दबाना इतना है कि यह गिलास coverslip का पालन करना होगा. संदंश से explant में एक खरोज दिखाई हो सकता है, यह सामान्य है.
- एक संस्कृति डिश पर सभी explants चढ़ाना के बाद, एक 37 के लिए स्थानांतरण ° सी इनक्यूबेटर. रेटिना axons चढ़ाना के बाद पहली बार 4-6 घंटे मनाया और explants कई दिनों के लिए स्वस्थ रहते हैं, लेकिन महत्वपूर्ण अतिवृद्धि 24 घंटे के बाद हो सकता है. Explants इन विट्रो assays में कई के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, 30 मिनट और immunostained (चित्रा 2) के लिए 4% पीएफए के साथ तय है.
सीमा परख
- वैकल्पिक रूप से, एक डिश है कि सीमा परख के लिए तैयार किया गया है (भाग 1 देखें) 4 GFP + explants हस्तांतरण. पकवान के केंद्र में एक ऊर्ध्वाधर पंक्ति में explants व्यवस्थित, सीमा के स्थान approximating.
- एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन विदारक थाली, के तहत explants ताकि वे फ्लोरोसेंट सीमा से ~ 50-150 मिमी हैं. 24 घंटे के लिए, 37 ° C पर बर्तन सेते RGC axons के लिए पर्याप्त समय की अनुमति करने के लिए सीमा सब्सट्रेट तक पहुँचने. Explants 4% पीएफए में 30 मिनट के लिए तय किया जा सकता है है, immunostaining (चित्रा 2) द्वारा पीछा किया.
प्रतिनिधि परिणाम
Discussion
इस वीडियो में, हम दोनों utero और पूर्व vivo में electroporation तकनीक, भ्रूण murine RGCs में जीन डिलीवरी के लिए प्रदर्शन किया है utero में रेटिना electroporation RGCs में जीन की अभिव्यक्ति जोड़ तोड़ के लिए एक तंत्र प्रदान करता है और vivo में अपने अक्षतंतु अनुमानों कल्पना. भ्रूण जीवित रहने की अनुमति दे postnatally अपने लक्ष्य में इन + GFP RGC अनुमानों की परीक्षा परमिट, पार्श्व geniculate (LGN) नाभिक पूर्व vivo रेटिना electroporation एक और अधिक नियंत्रित करने के लिए इन विट्रो assays में के साथ प्रयोग के लिए विशिष्ट रेटिना क्षेत्रों को लक्षित करने की क्षमता प्रदान करता है. और vivo में इन विट्रो इन तकनीकों से प्राप्त विश्लेषण में संयोजन RGC विकास और एक अन्यथा सामान्य पृष्ठभूमि में RGCs के एक सबसेट में अक्षतंतु अनुमानों की पूरी तरह से लक्षण वर्णन अनुमति देता है. हालांकि हमारे प्रदर्शन ऑप्टिक chiasm RGC अक्षतंतु मार्गदर्शन पर दोनों utero में और पूर्व vivo रेटिना electroporations अध्ययन कैसे जीन की अभिव्यक्ति प्रभाव RGC भेदभाव, वृक्ष के समान आकारिकी, electrophysiological गुण, synapse गठन और उचित में perturbations समाप्ति जैसे क्षेत्रों में लक्षित करने के लिए फायदेमंद हो सकता है, ध्यान केंद्रित LGN और बेहतर colliculus के रूप में.
Acknowledgments
हम utero और पूर्व vivo रेटिना electroporation तकनीक, क्रमशः के साथ मदद के लिए धन्यवाद डॉ. रिचर्ड वेली और Brikha श्रेष्ठ है, और इस प्रोटोकॉल पर टिप्पणियों के लिए डॉ. टी. Sakurai . यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान के संस्थानों NS051008 F31 (TJP), Fondation डालना ला Recherche MEDICALE, और मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम (ए आर) और EY12736 R01 (मुख्यमंत्री) द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BTX Electro Square Porator ECM 830 (with foot paddle) | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Round tweezer electrodes | Nepa Gene | CUY650-5 or CUY650-7 | |
| Silk Sutures | Henry Schein | 101-2636 | |
| Glass micropipettes with plungers | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | |
| Antibiototic-antimycotic | Invitrogen | 15240096 | |
| DMEM/F12 medium | GIBCO, by Life Technologies | 11330057 | |
| Albumin bovine serum | Sigma-Aldrich | A8806-5G | |
| ITS supplement | Sigma-Aldrich | I-1884 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 |
References
- Eye Retina and the Visual Systems of the Mouse. Chalupa, L. M., Williams, R. W. , MIT Press. Cambridge. (2008).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).
- Ishikawa, H. Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode. Gene Ther. 12, 289-298 (2005).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).
- Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-10 (2007).
- Petros, T. J., Shrestha, B. R., Mason, C. Specificity and sufficiency of EphB1 in driving the ipsilateral retinal projection. J Neurosci. 29, 3463-3474 (2009).
