Summary
この手法は、免疫組織化学または電気生理学的記録のためのショウジョウバエ胚の神経筋肉組織を公開します。それは神経筋発達の初期段階でイベントを勉強したり、孵化することができない変異体では電気生理学を実行する際に役立つ。
Abstract
ショウジョウバエ胚発生と機能的神経科学の両方の研究のための最高の遺伝的モデルです。伝統的に、これらのフィールドは非常に大部分が独立の歴史と科学的なコミュニティと、互いに分離されています。しかし、これらは通常異なる学問分野間のインターフェイスは、神経回路形成の最終段階、機能化学シナプスの機能的電気信号特性と分化の買収の基礎となる発生プログラムです。このインタフェースは、調査のために非常に重要な領域です。 ショウジョウバエでは、機能開発のこれらのフェーズは、胚発生の最後の3分の1の間（25℃）<8時間の期間中に発生します。この後期発達期間が長くタフな、不浸透性の表皮クチクラの堆積により調査に難治性と考えられた。画期的な進歩は、局所的に後期胚の制御解剖を有効にするためにキューティクルに適用できる水重合外科接着剤のアプリケーションでした。背側縦切開で、胚は実験的な調査に腹神経索と体壁の筋肉組織を露出させる、フラットなレイアウトすることができます。このシステムは、大きく胚性シナプス形成を損なうため、シナプスの接続と機能的なシナプス伝達特性の仕様と差別化を支配する分子メカニズムを明らかに遺伝的変異体を分離し、特徴付けるために使用されています。
Protocol
パート1：設備＆備品
- 良い解剖顕微鏡は、胚の解剖が必要です。40X倍率は25倍アイピース最大限に倍率を増加させると、示唆されている。
- ファイン鉗子（番号5）は胚と胚のdevitellinizationの手動選択のために必要とされています。
- 微細なガラス針を作成したり変更したりする機器が必要です。プルガラス針は解剖のために必要とされています。我々は解剖（長い最後）のために固体ガラスを好むが、標準的な肉厚ガラス管（外径1〜1.5ミリメートル）は同様に動作します。一部の人々は、10 +アンプの単巻変圧器の電池を使用して、1MのNaOHのバスで目的のシャープネスに電解細かいタングステン針を、使用してください。シャープタングステン郭清の針は、相対的に弾力性と長期的であることの利点を持っている。中空のガラス針は、（パッチクランプ電極に似て形成された）プラスチックチューブに取り付けられており、生理食塩水の吸引と追放のための解剖だけでなく、接着剤の制御された送達時に使用されます。ガラス引き手のさまざまなガラス針を製造するための用意されています。コンピュータにプログラムさ車夫は、形や大きさのさまざまなを引っ張ってプリセットすることができます。ブラウン - 炎のモデル（サッターインストゥルメント社）が広く支持されています。複合顕微鏡（20 - 40Xの目的は）使用前に電極を検査および変更できるようにする必要があります。
- 一般的に他の無脊椎動物のシステムの記録のために使用されるソリューションに基づいて、1）"標準"（月と月、1976a）や"変更された標準"（Broadie、2000）サラン：ソリューションの2つのタイプは、一般的にお風呂に解剖時の胚組織を使用している、および2）"体液のような"（HL）サラン（Stewartら1994）、標準の生理食塩水とショウジョウバエの体液で測定イオン濃度の間の妥協。それは、これらのSalinesのはどれも正確に生体内の体液の化学組成（Broadie、2000）模倣ないことに注意しなければならない。標準の生理食塩水が含まれる（mMで）：135塩化ナトリウム、5 KClを、4のMgCl 2、1.8 CaCl 2で 、72ショ糖、5 TES、pHは7.2。実験者はまた、電気生理学的記録には適さないが、露出の組織の健康を保護する可能性が最も高い商業的に調製された昆虫の生理食塩水を（例えばシュナイダーの昆虫メディア）、検討する必要があります。
パート2：胚のステージングと解剖
- 最適な卵のコレクションの場合は、2〜3日のための新鮮な卵ポットで（<7日間）、若い、健康なオスとメスのハエを（20-40）維持する。産卵ポットは、一般的に60 mmの寒天プレートをカバーする十分な空気循環を、提供するためにミシン目を100mlのプラスチックビーカー（トライ太）で構成されています。寒天プレートは、寒天で固めリンゴやブドウジュースが含まれています。いくつかのレシピが存在しますが、次のように1つの例です：水を700ml、25〜30グラムの寒天、濃縮ジュース（ぶどうやりんご）、0.5グラムメチルパラベン（P - hydroxymethylbenzoate）を300ml、および30gの砂糖を。水と寒天をオートクレーブし、別々に砂糖やジュースでのp - hydroxymethylbenzoateを煮る。寒天とジュースのソリューションを混在させるとすぐに泡を取り除く、60 mmのプレートに注ぐ。
- 採卵の前に、ハエは、少なくとも2日間に少なくとも1日2回に変更、新鮮なプレート上で酵母ペースト（7グラム4℃で保存されている水9mlののパン酵母° C）で供給されています。 3日目では、良好なポットは、時間あたり100から200の卵を生成する必要があります。より良い産卵は傷プレートの寒天とその側に維持ポットで観察されます。多くの胚は、年に置かや傷の隣になります。
- 胚を大量に収集するには、静かに絵筆を使ってバスケットに寒天プレートから胚を移す。バスケットは、15または50 ml遠心チューブで行うことができます。蓋とチューブの上部との間の画面（70μmのメッシュ）をトラップするのに十分な表面積を残して底部を切り取ります。のdH 2 0で胚をすすぎ、外側の絨毛膜を除去するために新鮮な50％〜100％漂白剤のペトリ皿に入れ。また、卵は細かい鉗子を使用して個別に採取し、漂白剤のドロップに、それらを手動で配置することによりdechorionatedすることができます。デchorionationは30秒から2分（新鮮な漂白剤がはるかに高速です）に連れて行くことができ、解剖顕微鏡下で監視する必要があります。絨毛膜の除去は、光沢、透明な卵黄膜を公開します。漂白剤は、急速にdevitellinized組織を破壊するとしてDechorionated卵は簡単に、すすぎ、または生理食塩水に配置する必要があります。
- それは慎重に、目的の発達年齢に胚を上演することが重要です。定義されているショウジョウバエ胚の段階では（1-17、カンポス、オルテガとハルテンシュタイン、1985）すべての機能神経筋の開発は、後期の16またはステージ17で発生するように、有用ではありません。このように、胚を25℃発育時間によって上演されている° Cの加湿インキュベーター中で、受精または後の時間で、より一般的に、産卵（AEL）の後。これらの条件下では、胚発生は21日続きます+ / - 25で1時間℃の
- 時限卵 - 素人（1〜2時間の卵適切に熟成されているのは）次の形態学的基準のために表示されています。のdH 2 Oで洗浄した後、dechorionated卵を表示するためのプラスチック製の培養皿（のdH 2 Oの下）に配置されます。正しいステージングは、解剖顕微鏡（カンポス-オルテガとハルテンシュタイン、1985）と反射光を用いて形態学的基準で確認することができます。孵化寸前の成熟後期の胚（22〜24時間AEL）は、一般的にキューティクルと膨張した気管のセグメンテーションによって認識されています。胚はまた、GFPバランサや適切なフィルターを使用した蛍光解剖顕微鏡を用いて遺伝子型を決定することができます。
- 解剖のために、dechorionatedと発達段階の胚は、生理食塩水のドロップ（ステップ1.5参照）の下にカバースリップ上に（最大背側）接続されています。胚はガラスのマイクロピペットまたはタングステン針を前方または後方の端の近くに膜を穿刺し、軽く膜から胚を解放することによって卵黄膜から削除されます。解剖の準備のために、胚を背側表面上にカバースリップ上に配置されるべきである（解剖まで背側は、実験のための腹側神経系と神経筋肉組織を公開することになります。しかし、胚が明らかに他へのアクセスを容易にするために、他の方法で配置できる組織。）
- 初期段階の胚は、（<16時間AEL）ポリリジン（; Broadieとベイト、1993a、Bポリ- L -リジン臭化水素酸塩）を塗布したガラスやガラスをきれいに直接接続。古い胚（> 16時間AEL）は、キューティクル形成に続いて、Sylgard被覆（ダウコーニング）をカバーガラスに理想的に、接着されている必要があります。水重合シアノアクリレート外科または獣医接着剤は、（Broadieとベイト、1993c、d）に使用されます。接着剤は、口腔内圧で制御される接着剤の流れでゴムチューブに取り付けられた小さなガラス電極のピペット（10〜20マイクロメートル、内径の先端）を介して配信されます。接着剤は、生理食塩水の接触により急速に重合するようにケアは、接着剤の配信中に注意する必要があります。接着剤は、二価イオンが重合するために必要と接着が、無または低価のイオン濃度と生理食塩水で実行できないことにも注意してください。接着剤の少量が最初にしっかりと頭と尾を添付するために使用されます。
- 胚の端はカバースリップに接着されると、切開は、ガラス電極または尖ったタングステン針で背側正中線に沿って行われます。これは、静かに最後のカットを行う前に切開線を穿孔によって容易になります。切開の側面は、その後ゆっくりと胚のフラットを広めるために、より多くの接着剤でカバーに取り付けられている。腸を含む内臓、脂肪体と、は、必要に応じて、気管は、ゴムチューブ（Broadieとベイト1993a - C）に接続されているガラスピペットを用いて吸引して除去する。胚は今腹中枢神経系、末梢神経、および実験のために露出身体の筋肉組織と表皮下に、カバースリップにフラット添付する必要があります。
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Discussion
胚の正確なステージングは、原因だけで数時間の時間の経過とともに機能的特性の急激な成熟に重要です。いくつかの問題は、このステージングを複雑にする。最初に、ほとんどの研究者は、タイミング卵の段階の胚に産むを使用していますが、産卵時には、別の条件（Broadieら1992）で、動物から動物に非常に異なることがあります。特に、限られた食事療法で女性は前の敷設に長時間にわたって受精卵を保持する傾向がある。それは最低2日前までに、リッチな酵母食を食べて卵を（Broadieら1992）を収集することにより、"明確な"女性のため、非常に重要です。また、高齢女性はまた、前の産卵まで長い期間、卵を保持する。高齢女性は、日常的に前に彼らの孵化にのみ卵数時間を置くことができる。それは最も一貫性のある産卵回数（Broadieら1992）のために若い女性を（<7日間）使用することが重要である。第二に、後期胚の段階で、それは形態学的基準によってのみ胚をステージングすることは困難です。最も明確なステージング機能が完成すると<16時間AEL（カンポス-オルテガとハルテンシュタイン、1985）が、ほとんどの機能的な開発が発生する> 16時間のAELを。後半の発達の特徴（例えば気管空気充填、キューティクルの日焼け）が少なく、あまり時間的に制限する傾向がある。これらの理由から、我々は、コンビナトリアル手法をお勧めします：1〜2から卵を収集する時間タイムアウトの期間が<30分の明確に定義された初期の形態学的事象（例えば原腸形成、背部閉鎖、3部の腸に、ステージを産む、カンポス、オルテガとその後、ハルテンシュタイン、1985）とは、よく制御25℃インキュベーター内の目的の年齢にインキュベートする。
手動の解剖と接着剤のアプリケーションでは、少数の人々が最初に所有している顕微鏡で細かい運動能力を必要とする。これらのスキルは、時間をかけて開発する必要があります。実験者は成功の高い周波数を期待する前に、毎日専用の練習の数週間の最小値をコミットすることをいとわないしてください。電気生理学に適した健康的な準備は、通常より多くの努力が必要となることでしょうCNSといくつかの腹側神経筋接合部の顕微鏡検査に適した製剤には、比較的迅速に達成可能なはずです。
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Acknowledgments
KBはNIH助成金GM54544によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 (for 60 mm dish; other sizes available) | Cages can also be home made using punctured tri-pour beakers, as shown in video |
| Sylgard 184 | Dow Corning | Available from various companies | Surgical glue adheres better to sylgard-coated coverslips |
| Fine glass tubing, outer diameter 1.0-1.5 mm | Various | For pulling into fine glass needles for dissection and tubes for glue delivery | |
| Plastic tubing, to attach to glass pipette for mouth suction and glue application | Tygon | Tubing inner diameter needs to match glass outer diameter. |
References
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