Summary
Bin kan konditioneras i en appetitive lukt lärande (per-konditionering). Använda lukter som stimuli, etablerade vi en metod där beteende är inspelade samtidigt Kalcium Imaging används för att mäta lukt framkallade aktivitet i svamp kroppens nervceller
Abstract
In vivo-och semi-in vivo inför Kalcium avbildning har utvecklats i vårt labb med Joerges, Kuttner och Galizia över tio år sedan, för att mäta lukt framkallade aktivitet i antennal lob 1. Från och med då har det varit hela tiden förfinats och används på olika neuropiles i biet hjärnan. Här beskriver vi förberedelserna för närvarande används i labbet för att mäta aktiviteten i svamp kroppen nervceller med hjälp av en dextran kopplad kalcium-känsliga färgämne (Fura-2). Vi fläcken retrogradely svamp kroppens nervceller genom att injicera färg i sina axoner eller soma regionen. Vi fokuserar på att minska invasivitet att uppnå ett preparat där det fortfarande är möjligt att träna biet med PER konditionering. Vi har möjlighet att övervaka och mäta beteendemässiga svar genom att spela in elektro-myograms från den muskeln som styr PER (M17) 2.
Efter fysiologiska experimentet avbildade strukturer undersöks närmare med hjälp av konfokal scanning mikroskopi för att hantera identitet nervceller.
Protocol
Bee Beredning och Back-fylla
- Catch fälthackar honungsbiet på bikupor och chill på is för immobilisering.
- Montera i plexiglas inspelning kammare 3. Fäst ögon och bröstkorgen på väggarna av inspelningen kammare med låg smältpunkt hårt vax.
- Dra glas kapillärer som vanligen används för elektrofysiologi och bryta i spetsen för att få ett tips diameter på ca. 10μm. Täck toppen av kapillär med färg pasta. Dye klistra består av en 10:01 blandning av Fura-2 dextran och lysin fastställbara tetramethylrhodamine dextran.
- För färgningsproceduren immobilisera antenner med detaljer eller n-eicosane. Ta bort en bit av nagelband över hjärnan och tryck körtlar och luftstrupe åt sidan för att ge tillgång till svamp kroppen.
- Injicera kapillärer i antingen soma eller axonal region svamp kroppens nervceller. Detta kan göras fri hand eller med hjälp av en mikro manipulator. Sedan återställa nagelband bit på huvudet kapsel och lossa antenner.
- Feed bin med 30% sackaroslösning innan du förvarar dem i en fuktig fall under minst fyra timmar eller över natten vid 20 ° C.
In vivo Imaging
- Förhindra rörelser biet t.ex. med en liten bit svamp som pressas mot buken och fast med en klämma eller tejp på inspelningen kammaren.
- Att förhindra förflyttning av hjärnan till följd av pumpning av matstrupen, skär ett litet snitt i nagelbanden ovanför labrum och dra ut försiktigt i matstrupen och dess omgivande strukturer för att uttrycka det under spänning utan att skada matstrupen 4. Täck med tvåkomponents silikon.
- Gör hål med en nål och stick tråd elektroder för registrering av M17.
- Ta bort nagelband bit, luftstrupe och körtlar över hjärnan. Suck heamolymph inne i huvudet kapsel med en bit papper.
- Fyll huvudet kapsel med två komponent silikon. Det är viktigt att hjärnan är helt täckt.
- Placera Bi på mikroskop scenen och placera en droppe vatten på ytan av silikon för att fördjupa den dopp målet för mikroskop i droppen. Fokus på färgade nervceller.
Lukt stimulering och registrering av signaler
Olfactometer: Vi använder en datorstyrd, egenbyggda stimulans enhet eller "olfactometer" som beskrivs tidigare av Galizia och Vetter 3. Lukter späds till en konstant luftström riktas mot antennerna. Varje stimulans består av en 3s lukt puls av 0,2 lukt mättade luften. Den stimulans protokoll kan ställas in i inspelningsprogrammet TILLVision.
Mikroskop och Imaging set-up: Vi använder en Zeiss fluorescensmikroskop. Bilderna lagras vid 25 ° C med en samplingsfrekvens-kurs om 5 Hz med ett TILL-fotonik bildenhet monteras på mikroskopet. Kalcium signaler registreras via en X60, 0,9 W Olympus dopp mål med en Imago CCD-kamera (640x480 pixlar, 4X binned på chip till 160x120 pixlar). Fura-2 är glada med monokromatiskt ljus av 340 och 380nm våglängd för ratiometrisk mätningar. Fluorescens upptäcks genom en 410nm dikroisk spegel och en 440 lång passning filter. Parametrarna för inspelningen ställs in i inspelningsprogrammet. Varje mätning varar 10s och exponeringstid för de två våglängder kan anpassas till färgningsintensitet i varje beredning.
M17 inspelning: gradskiva muskeln i labium (M17) registreras extracellularly att övervaka beteendemässiga reaktioner i samband med inlärning, dvs PER 5, 6. Injicera en koppartråd i muskeln nära munnen delarna. Injicera jordelektrod i ögat. Muskeln potentialer förstärks med en anpassad bygga förförstärkare, digitaliserade och lagras på en dator. Stimulus debut utlöses av olfactometer.
Data Analysis
- Under experimentet: De inspelningar av kalcium signalen matas in i en dator och lagras. Inspelningen mjukvaran TILLVision gör en första inspektion av signaler, liksom beräkning av förhållandet mellan de våglängder (340nm/380nm) och beräkning av deltaF (subtraktion av utgångsvärdet).
- Bildbehandling sker med egna skrivna program i IDL. Beräkna förhållandet Ca 2 +-signaler från 340nm och 380nm mätningar för varje pixel. Bestäm bakgrundsfluorescens (F) som genomsnittet över bilder innan den stimulans och subtrahera från ratiometrisk signalen (deltaF).
- För att definiera regionen av intresse (ROI): Beräkna medelvärdet av ramar under stimulans och tillämpa ett lågpassfilter (3X3px). Konvertera gråskalan till false färgskala. Bestäm aktiviteten i neuronala strukturer som verksamheten fläckar i falska färgbilder och definierar som ROI.
- Beräkna temporala dynamiken i de aktiva regionerna som genomsnittet av de pixlar i ROI över alla ramar utan någon filtrering eller korrigering.
Tillsammans med Fura-2 dextran vi fyller nervceller med fastställbara dye Rhodamine dextran ("mini-ruby"). Båda färgämnen har samma molekylvikt, de ska samlokaliseras i nervceller. Wide-området imaging tillåter endast en mycket begränsad rumslig upplösning, därför rekommenderas att undersöka färgade strukturer efter försöket med konfokala scanning mikroskopi.
- Efter fysiologiska mätningar, dissekera hjärnor och fixera.
- Skölj i PBS och stegvis torka i etanol och tydlig i metyl salycilate.
- För konfokalmikroskopi bädda in hjärnan i metyl salycilate.
- Vi använder en Leica TCS SP2 mikroskop. Excitation våglängd 543nm.
- Vi skannar hjärnan med en luft-eller oljeimmersion mål och jämföra det färgade strukturer med bilddata.
Representativa resultat:
Om färgning och förberedelser lyckades signalen i falska färgskala, till exempel i svamp kroppen alfa lob yttre nervceller, skulle kunna se ut i figur 1.
Den beteendemässiga svar (PER) kan beräknas som Spike frekvens under stimulans minus spiken frekvens innan stimulus (figure2).
Den färgade strukturer kan utredas mer i detalj med hjälp av ett konfokalmikroskop (figur 3).
Figur 1: Representativa Kalcium Imaging signaler (stimulering med heptanal). A: avbildade region i binas hjärna. B:, Raw fluorescerande bild som ses genom en X20 dopp mål på 380nm excitationsvåglängden är alfa-lob i svamp kroppen beskrivs i lila. Dye var injiceras i ventro-laterala kanten av alfa-loberna att färga yttre nervceller. C: Falska färgbild härlett från de genomsnittliga signalen, deltaF (340/380) under de tre andra stimulanspaket, alfa-loben som beskrivs i lila, beskrivs utvalda ROI i svart. D: Temporal dynamik kalcium signaler som svar på lukt stimulering, genomsnitt signalen från regionen av intresse som anges i C. E: Temporal dynamik kalcium signaler som svar på sackaros stimulering av ipsi-och kontra-laterala antenn respektive till ROI angivna i C.
Figur 2: Representant M17 svar. Efter lukt konditionering biet förlänger snabel när lukten presenteras utan belöning. Röd linje visar lukt stimulans. Infälld: PER av honungsbiet.
Figur 3: Representant bildstapel. Efter imaging experiment hjärnan var dissekeras. Neuron av figur 1 är skannas med en konfokalmikroskop med en X20 oljeimmersion mål, alfa-loben som beskrivs i lila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna presentation har vi gått igenom alla steg för att undersöka in vivo kalcium signaler i honungsbiet. Vi tillämpat denna teknik för att svamp kroppens nervceller, men bildbehandling kan göras på alla nervceller som en målningsteknik kan fastställas. Vi har fokuserat på nervceller i lukt väg av honungsbiet. Experimenten är alla utförs i ett mörkrum. Inrättandet belyses med en lång våg ljus som ligger utanför optiska uppfattningen räckvidd bee och inte uppväcka färgämnen. Det är viktigt att undvika fluorescerande artefakter, för bubblor exempelvis luft i silikon.
En av de stora fördelarna med detta system är möjligheten att smaka information om aktiviteten i nervceller med tidsmässiga och geografiska. Samtidigt kan vi iaktta gällande beteende i biets när t.ex. lära relaterade plasticitet i nervceller ska utredas. Men den tidsmässiga och geografiska begränsad. Med in vivo kalcium avbildning, är experimentell tidsbegränsad. Samtidigt, med extracellulära elektrofysiologiska metoder kan inspelningar pågå i flera timmar eller dagar, är våra experiment begränsad till ca 90 minuter. Signaler är fortfarande ganska bra när vi gör 85 mätningar med excitation av två våglängder vid en 5Hz samplingshastighet, varje mätning som varar 10 sekunder, 340nm exponering är 20ms och 380nm exponering bestående 5ms, respektive. Efteråt färgämne blekning kan bli ett problem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete finansieras av DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| low melting point hard wax Deiberit 502 | Dr. Böhme Schöps Dental GmbH | ||
| FURA-2 dextran potassium salt, 10 000 MW | Invitrogen | F-3029 | Protect from light. |
| tetramethylrhodamine dextran 10 000 MW | Invitrogen | D-3312 | Protect from light. |
| n-eicosane | Sigma-Aldrich | 21, 927-4 | |
| Kwik Sil Adhesive | World Precision Instruments, Inc. | KWIK SIL | |
| Imaging Set-up | TILL Photonics | ||
| CCD camera | Imago | ||
| CED | Texas Instruments |
References
- Joerges, J., Küttner, A., Galizia, C. G., Menzel, R. Representations of odors and odor mixtures visualized in the honeybee brain. Nature. 387 (6630), 285-288 (1997).
- Rehder, V. Quantification of the honeybee's proboscis reflex by electromyiographic recordings. J. Insect Physiol. 33, 501-507 (1987).
- Galizia, C. G., Vetter, R. S. Optical Methods for Analyzing Odor-Evoked Activity in the Insect Brain. Methods in Insect Sensory Neuroscience. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 345-388 (2004).
- Mauelshagen, J. Neural correlates of olfactory learning paradigms in an identified neuron in the honeybee brain. J Neurophysiol. 69 (2), 609-625 (1993).
- Kuwabara, M. Bildung des bedingten Reflexes von Pavlovs Typus bei der Honigbiene Apis mellifica, Hokaido Univ. Zool. J. Sci. 13, 458-464 (1957).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera. Journal of Comparative Psychology. 97 (2), 107-119 (1983).
