Summary
Arılar iştahlı bir koku alma öğrenme paradigması (PER-condition) klimalı olabilir. Uyaranlara gibi kokular kullanarak, aynı anda Kalsiyum Görüntüleme koku uyarılmış mantar vücut nöron aktivitesini ölçmek için kullanılır kaydedilir hangi davranış bir yöntem kurdu
Abstract
Antennal lob 1 in vivo ve yarı-Kalsiyum görüntüleme için in vivo hazırlık Joerges, Kuttner ve Galizia laboratuarımızda geliştirilmiştir üzerinden on yıl önce, koku uyarılmış aktivitesini ölçmek için. O andan itibaren, sürekli olarak rafine edilmiş ve arı beyni farklı neuropiles uygulanır. Burada henüz bir dekstran birleştiğinde kalsiyum duyarlı boya (Fura-2) kullanarak mantar vücut nöron aktivitesini ölçmek için laboratuarda kullanılan hazırlık açıklar. Biz retrograd mantar vücut nöronların aksonları ya da soma bölge içine boya enjekte edilerek leke. Biz klima BAŞINA kullanarak arı yetiştirmek için hala mümkün olduğu bir hazırlık elde etmek için, invazivlik azaltarak odaklanmak. PER (M17) 2 kontrol eden kas elektro-myograms kayıt davranışsal tepki ölçmek ve izlemek mümkün.
Fizyolojik deney sonra görüntülü yapılar nöronların kimlik adresine konfokal tarama mikroskobu kullanılarak daha ayrıntılı olarak incelenmiştir.
Protocol
Arı Hazırlık ve Geri dolgu
- Immobilizasyon için buz üzerinde kovanı ve soğuk bal arısı yem yakalayın.
- Pleksiglas odaları 3 kayıt Dağı. Gözleri ve göğüs düşük erime noktası sabit balmumu ile kayıt odasının duvarları sabitleyin.
- Elektrofizyoloji için yaygın olarak kullanılan cam kılcal damarların çekin ve yaklaşık bir ucu çapını elde etmek için ucunda kırmak. 10μm. Kapak boya macun ile kılcal ucu. Boya yapıştırın Fura-2 dekstran ve lizin tamir edilebilir tetramethylrhodamine dekstran 10:01 karışımından oluşur.
- Boyama işlemi için önemsiz ayrıntılar veya n-eicosane antenler hareketsiz. Beyin yukarıda manikür bir parça çıkarın ve mantar vücut erişimine izin vermek yan bezleri ve trakea itin.
- Soma veya mantar vücut nöronların aksonal bölge içine kılcal damarların enjekte edilir. Bu serbest elle yapılan veya mikro manipülatör kullanarak olabilir. Sonra baş kapsül kütikula parça geri ve antenler gevşetin.
- % 30 sukroz solüsyonu ile arılar Yem nemlendirilmiş bir durumda onları en az dört saat süreyle saklamadan önce ya da gece boyunca 20 ° C
In vivo Görüntüleme
- Karın karşı bastırdı ve kayıt odasına bir klip veya bant ile sabit küçük bir parça sünger ile arı, örneğin hareketleri engelleyin.
- Labrum yukarıdaki manikür, yemek borusu pompa kaynaklanan beyin hareketi önlemek için, içine küçük bir kesi kesme ve yemek borusu dikkatlice dışarı çekin ve çevresindeki sağlam yapılar, yemek borusuna 4 zarar vermeden gerilim altında koymak. Iki bileşenli silikon ile kaplayın.
- Bir iğne ile delik açın ve M17 kayıt için tel elektrotlar eklemek.
- Kütikula parça, trakea ve beyin üzerinde bezleri çıkarın. Bir kağıt parçası ile baş kapsül içinde heamolymph Suck.
- Iki bileşenli silikon ile baş kapsül doldurun. Beyin üstünün tamamen kapalı olduğundan çok önemlidir.
- Mikroskop sahne arı ve damlacık içine mikroskop daldırma amacı batırmayın silikon yüzey üzerinde bir damla su yerleştirin. Lekeli nöronlar odaklanın.
Koku uyarılması ve kayıt sinyallerin
Olfactometer: Biz bir bilgisayar kontrollü, özel olarak inşa stimülasyon cihazı veya Galizia ve Vetter 3 tarafından daha önce açıklandığı gibi "olfactometer" kullanın. Kokular antenler yönelik sürekli bir hava akışı içine seyreltilir. Herhangi bir uyaran bir 3s koku darbe 0.2ml koku doymuş hava oluşur. Stimülasyon protokolü kayıt yazılımı TILLVision ayarlanabilir.
Mikroskop ve Görüntüleme set-up: Biz Zeiss bir floresan mikroskop kullanıyoruz. Görüntüler 25 ° C mikroskop üzerine monte edilmiş bir KADAR-Fotonik görüntüleme cihazı kullanarak 5 Hz'lik bir örnekleme hızı ile kaydedilir. Kalsiyum sinyalleri bir X60, 0.9 W Olympus Imago CCD kamera (640x480 piksel, 160x120 piksel çip üzerinde binned 4X) daldırma amacı ile kayıt altına alınmaktadır. Fura-2 monokromatik 340 oranlı metrik ölçümleri için ışık ve 380nm dalga boyu ile heyecanlı. Floresan 410 dikroik ayna ve 440nm uzun geçiren filtre ile tespit edilir. Kayıt yazılımı kayıt için parametreler ayarlanır. Her ölçüm iki dalga boylarında ve pozlama süresi 10s her hazırlık boyama yoğunluğu ayarlanabilir sürer.
M17 kayıt: labium (M17) iletki kas öğrenme ile ilgili davranışsal tepkilerin izlemek için ekstraselüler kaydedilir BAŞINA 5, 6, yani. Bakır tel ağız parçaları yakın kas içine enjekte edilir. Toprak elektrot göz içine enjekte edilir. Kas potansiyelleri, özel bir yapı pre-amplifikatörü ile amplifiye sayısallaştırılmış ve bir bilgisayarda depolanır. Stimulus başlangıçlı olfactometer tarafından tetiklenir.
Veri Analizi
- Deney sırasında bir bilgisayar içine kalsiyum sinyal kayıtları beslenir ve saklanır. Kayıt yazılımı TILLVision dalga boylarında (340nm/380nm) ve deltaF (bazal çıkarma) hesaplanması arasındaki oranın hesaplanması gibi, sinyallerin bir ilk denetim sağlar.
- Görüntü işleme IDL özel yazılmış programlar ile yapılır. Ca 2 + 340nm gelen sinyalleri ve her piksel için 380nm ölçüm oranını hesaplayın. Uyaran önce kare ortalama eşiğe (F) belirlemek ve oranlı metrik sinyali (deltaF) çıkarmak.
- Faiz (ROI) Bölge tanımlamak için: uyaran sırasında kare ortalama ve bir alçak geçiren filtre (3X3px) uygulamak hesaplayın. Yanlış renk skalası gri ölçekli dönüştürün. Sahte renkli görüntüler faaliyet lekeler olarak nöronal yapılardaki aktiviteyi belirleyin ve yatırım getirisi olarak tanımlamak.
- Herhangi bir filtreleme veya düzeltme olmadan tüm kareleri üzerinde yatırım getirisi piksellerin ortalamasını alarak aktif olan bölgelerin geçici dinamikleri hesaplayın.
Fura-2 dekstran ile birlikte biz tamir edilebilir boya rodamin dekstran ("mini yakut") ile nöronların doldurun. Her iki boyalar aynı moleküler ağırlığa sahip nöronlar birlikte yer almalıdır. Geniş açılı görüntüleme, sadece çok sınırlı uzaysal çözünürlüğü sağlar, bu nedenle konfokal tarama mikroskobu kullanılarak deney sonra lekeli yapılarını araştırmak için tavsiye edilir.
- Fizyolojik ölçümler sonrası, beyin incelemek ve sabitleşmek.
- PBS ve kademeli dihidrat etanol ve metil salycilate net durulayın.
- Konfokal mikroskobi için metil salycilate beyin gömün.
- Biz Leica TCS SP2 mikroskop kullanıyoruz. Dalgaboyu 543nm.
- Biz bir hava veya yağ daldırma amacı ile beyin tarama ve lekeli yapıların görüntüleme verileri ile karşılaştırmak.
Temsilcisi Sonuçlar:
Boyama ve hazırlık başarılı olursa, yanlış renk skalası sinyal, mantar vücut alfa lob ekstrensek nöronlar Örneğin, Şekil 1 gibi görünebilir.
(PER) ve davranışsal tepki, uyarana (Şekil 2) önce uyaran eksi başak frekans sırasında başak frekans olarak hesaplanabilir.
Lekeli yapılar, konfokal mikroskop kullanılarak (Şekil 3) daha ayrıntılı araştırılması olabilir.
Şekil 1: Kalsiyum Temsilcisi Görüntüleme sinyalleri (heptanal ile stimülasyon). A: arı beyni görüntülenmistir bölge. B: 380nm dalgaboyu X20 daldırma amacı ile görüldüğü gibi ham floresan görüntü, mantar vücudun alfa-lob mor özetlenen. Boya ekstrensek nöronlar leke alfa-lobların ventro-lateral kenarı içine enjekte edildi. C: üç ikinci uyaran sırasında ortalama sinyali deltaF (340/380), türetilmiş Yanlış renkli görüntü; mor belirtilen alfa-lob, seçilen ROI siyah sıraladı. D: koku stimülasyon, C. E belirtildiği gibi ilgi bölgeden ortalama sinyal yanıt Geçici kalsiyum sinyal dinamikleri: ROI sırasıyla sukroz uyarılması IPSI ve kontra-lateral anten yanıt kalsiyum sinyal Geçici dinamikleri, C. içinde
Şekil 2: M17 yanıt Temsilcisi. Koku alma Klima sonra arı koku ödül olmadan burnumun uzanır. Kırmızı çizgi, koku uyaran gösterir. Ankastre: balarısı, PER.
Şekil 3: Temsilci görüntü yığını. Sonra beyin görüntüleme deney disseke edildi. Şekil 1 nöron mor belirtilen bir X20 immersiyon yağı amacı, alfa-lob ile konfokal bir mikroskop kullanılarak taranır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu sunumda, balarısı in vivo kalsiyum sinyallerini araştırmak için tüm adımları aracılığıyla gitti . Biz mantar vücut nöronlar için bu tekniği uygulanabilir, ancak bir boyama tekniği kurulacak olan bütün nöronlar üzerinde görüntüleme yapılabilir. Biz bal arısı koku yol nöronların odaklanmıştır. Deneyleri bir karanlık oda yapılır. Kurmak arı optik algılama aralığı yalan ve boyalar heyecanlandırmak değil uzun dalga boyundaki ışık ile aydınlatılır. Örneğin silikon hava kabarcıkları, herhangi bir flüoresan bozulmaları önlemek için önemlidir.
Bu sistemin en önemli avantajlarından biri, mekansal ve zamansal çözünürlük ile nöron faaliyetleri hakkında bilgi örnek olasılığıdır. Örneğin nöron öğrenme ile ilgili plastisite araştırılmalıdır Aynı zamanda, biz arı ilgili davranışlarını gözlemlemek olabilir. Ancak, mekansal ve zamansal çözünürlüğü sınırlıdır. In vivo kalsiyum görüntüleme kullanarak, deneysel süresi sınırlıdır. Ekstrasellüler elektrofizyolojik yöntemlerle, kayıtları, birkaç saat veya gün sürebilir, iken, deneyler, yaklaşık 90 dakika ile sınırlıdır. Biz bir 5Hz örnekleme oranı, her bir ölçüm 10 saniye süren, 20ms ve 380nm maruz kalıcı 5ms, 340nm maruz kalma, sırasıyla iki dalga boylarında uyarma ile 85 ölçüm gerçekleştirdiğinizde sinyaller yine de oldukça iyi. Daha sonra bir sorun haline gelebilir beyazlatma boya.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma DFG tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| low melting point hard wax Deiberit 502 | Dr. Böhme Schöps Dental GmbH | ||
| FURA-2 dextran potassium salt, 10 000 MW | Invitrogen | F-3029 | Protect from light. |
| tetramethylrhodamine dextran 10 000 MW | Invitrogen | D-3312 | Protect from light. |
| n-eicosane | Sigma-Aldrich | 21, 927-4 | |
| Kwik Sil Adhesive | World Precision Instruments, Inc. | KWIK SIL | |
| Imaging Set-up | TILL Photonics | ||
| CCD camera | Imago | ||
| CED | Texas Instruments |
References
- Joerges, J., Küttner, A., Galizia, C. G., Menzel, R. Representations of odors and odor mixtures visualized in the honeybee brain. Nature. 387 (6630), 285-288 (1997).
- Rehder, V. Quantification of the honeybee's proboscis reflex by electromyiographic recordings. J. Insect Physiol. 33, 501-507 (1987).
- Galizia, C. G., Vetter, R. S. Optical Methods for Analyzing Odor-Evoked Activity in the Insect Brain. Methods in Insect Sensory Neuroscience. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 345-388 (2004).
- Mauelshagen, J. Neural correlates of olfactory learning paradigms in an identified neuron in the honeybee brain. J Neurophysiol. 69 (2), 609-625 (1993).
- Kuwabara, M. Bildung des bedingten Reflexes von Pavlovs Typus bei der Honigbiene Apis mellifica, Hokaido Univ. Zool. J. Sci. 13, 458-464 (1957).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera. Journal of Comparative Psychology. 97 (2), 107-119 (1983).
