Summary
在这段视频中，我们展示了开发和验证的表皮皮肤刺激性试验（表皮薛）
Abstract
表皮皮肤刺激性试验（表皮薛）
Protocol
一，组织空调 - 0天
- 收到的表皮EPI - 200 -薛套件后，检查所有的完整套件组件（套件的详细信息，请参阅特定的试剂和仪器表）。
- 每三个表皮组织，准备一个无菌6孔板与检测介质0.9毫升预填充。
- 在无菌条件下，打开塑料袋中含有的24孔板中，含有表皮组织和取出的无菌纱布。
- 用无菌镊子删除每个插入含有表皮组织和地方插入空的24孔板。在这一步，删除任何剩余的航运琼脂糖，坚持插入外侧轻轻印迹无菌滤纸上。
- 接下来的5分钟之内，目视检查的组织。不要使用有缺陷的组织或组织与液体完全覆盖。
- 使用无菌棉头棉签，精心组织表面干燥。尽量不要直接接触的组织 - 毛细管效应，足以消除组织表面的水分。
- 组织表面干燥后，将三个组织的6孔0.9毫升检测介质预填充板的最上面一行。释放被困插入下方的空气气泡。
- 将6孔板进入孵化器的插入包含为60 ± 5分钟预培养于37 ± 1 ° C，5 ± 1％的CO 2，95％RH（相对湿度）。
- 在60 ± 5分钟前潜伏期月底，从上部井转移到6孔板较低井插入。放入孵化器板（37 ± 1 ° C，5 ± 1％的CO 2，95％相对湿度）过夜预培养（18 ± 3小时）。
- 其余的检测介质放入冰箱（5 ± 3℃）。继隔夜预培养，可用于测试化学品的表皮组织。
注：预孵化过程可以缩短下旬组织交付的情况下（例如，如果组织周二周三抵达 ）。
二。化学品接触 - 第1天
- 准备灌装只用0.9毫升，每口井的实验介质上排每一个测试化学品的6孔板。
- 计划暴露于化学品前约5分钟，取出6孔板，从孵化器的预调节组织。
- 评估组织的表面和消除任何水分，用无菌棉。
- 测试材料代码或名称，标签所有6孔板盖。
- 剂量在1分钟的时间间隔试品的组织，以方便曝光后试品的冲洗。保持剂量组织在无菌罩板，直到最后组织剂量。
- 要测试液体化工品，免除直接顶上组织30μL的解决方案和地方组织表面上的尼龙网眼。如果有必要，轻轻网使用为首的玻璃巴斯德吸管灯泡的位置。不要按组织表面上。
- 对于测试semisolids，使用正排量吸管免除30μL直接顶上组织。如果必要的传播与巴斯德吸管化学覆盖组织表面尽可能。
- 对于固体材料，不久之前，应用程序的测试物质，滋润与25μL无菌DPBS组织表面。这将改善与测试化学品的组织表面的接触。填写细磨测试材料约25毫克25毫克校准尖锐的应用汤匙（或任何其他合适的工具）。应用组织表面的固体化学测试。如果有必要，可以使用一个灯泡为首的巴斯德吸管完全空勺子。轻轻摇动插入提高的固体表面上蔓延。
- 糯一致性测试物质，努力形成直径约8毫米平坦的一块“如cookie”，在和地方组织之上，这是以前用无菌DPBS湿。为了提高测试的物质和组织之间的接触，权衡下来用不锈钢或塑料援助“曲奇”。
- 应用作为阴性对照和5％作为阳性对照，以控制组织的SDS DPBS。
- 服药后的最后组织，所有板块为35 ± 1分钟转移到培养箱（37 ± 1 ° C，5 ± 1％的CO 2，95％相对湿度）。
- 后35 ± 1分钟的潜伏期在37 ° C删除所有的盘子从孵化器。放入无菌罩板和等待，直到60分钟的化学品接触的期限为第一剂量组织完成。
- 之后开始洗涤过程使用一个插入每分钟的时间间隔（以insurE的为每个插入的总曝光时间是60分钟）。
- 使用洗瓶冲洗用无菌DPBS的组织。 15次使用的DPBS络绎不绝填充插入组织和空，它（注：用尼龙网眼组织，洗净组织表面的5倍，并仔细指出，尖锐的钳取出网状之后，继续与其余10涤）。
- 15日冲洗后使用的洗瓶，完全淹没在150毫升DPBS插入的3倍和动摇删除测试材料的其余部分。
- 最后，冲洗一次插入组织内，一旦从外面用无菌DPBS。
- 取出轻轻晃动插入和印迹无菌吸墨纸任何多余的组织DPBS。
- 抹杀的组织插入转移到新的6孔板以前检测介质预填充。必须为每个插入1分钟内完成所有这些步骤（14-18）。
- 去年组织冲洗后，仔细地干各组织的表面，用无菌棉放倒棉签。
- 在接下来的24 ± 2小时，在孵化器孵育组织（37 ± 1℃，5 ± 1％的CO 2，95％相对湿度） 。
注：每次检测技术人员不应该测试超过6人，包括在一个单一的测试运行（套）的阴性和阳性对照的测试物质，能够按照协议，如下所述
三。换液 - 第2天
- 后24 ± 2小时培养后，转移到下部的6孔板，用0.9毫升的媒体预填充的插入。额外的端点（细胞因子，趋化因子等）的分析，可以收集来自上游行的媒体。次要终点的分析是可选的。
- 孵化后继续（37 ± 1℃，5 ± 1％的CO 2，95％RH）为18 ± 3小时。
四。 MTT可行性含量 - 3天
- 标签两个24孔板的化学名称或代码。一个板块将成为组织孵化用MTT法和其他提取步骤。
- 准备解冻的MTT液（5毫克/毫升）和MTT法稀释剂稀释MTT溶液。 MTT溶液的最终浓度为1毫克/毫升。
- 吸取300μLMTT溶液到每孔24孔板。
- 从孵化器中删除的6孔板，印迹在吸墨纸插入底部，并转移到24孔板中，用MTT预填充。
- 在孵化器将24孔板（37 ± 1℃，5 ± 1％的CO 2，95％相对湿度）孵育3小时± 5分钟。严格遵守3小时± 5分钟的孵化时间，以避免不同的MTT法读数偏差。
- 当MTT法孵化完成后，用吸泵，轻轻吸出所有的水井的MTT介质。
- 笔芯与DPBS井和吸一次。重复这个漂洗两次以上，并确保最后的愿望后，组织干。
- 清洗后的转移插入到一个新的24孔板。沉浸轻轻移液2 mL的萃取溶液（异丙醇）插入到每个插入。插入上部边缘以上的水平将上升，从而完全淹没的组织。
- 密封的24孔板中（例如，使用密封袋封口膜或），抑制萃取蒸发。温柔摇晃一盘摇床（〜120 RPM）从组织提取物在室温下至少2小时的MTT。也可用于无晃动隔夜提取。
- 提取期间完成后，皮尔斯与注射针头，或串珠巴斯德吸管灯泡和允许提取运行以及从中插入插入。
- 丢弃刺破插入吸管的解决方案，以及向上和向下三次，直到它是均匀的。
- 对于每个组织，转移到一个96孔平底微孔板的两个紫色的甲臜解决方案200μL等份。根据这个视频协议所附的电子表格中的固定板设计的重复传输。对于空白，使用异丙醇。
- 阅读MTT法提取的光密度（OD值）在96孔板分光光度计，使用波长570纳米（540-580）无参考过滤器。
- 在电子表格自动计算的结果（图1）输入的结果。
- 测试的化学物质是标有“刺激性”（R38或综合住户统计调查第2类），MTT法测定的％的组织活力，如果是<50％，相对于阴性对照。
注意：MTT法是有毒的，所以处理时一定要戴防护手套。保护MTT和其所以由轻，因为MTT法lutions对光敏感。 MTT溶液配制后几个小时内使用，因为它随着时间的推移降低。
五，检测质量控制
表皮的EPI - 200 -薛套件的验收标准：
在体外 RHE模型应该提供一致，高质量的数据，随着时间的推移，不只是在验证过程中（8） 。建议的指引，以确保长期测定的重现性和性能，包括“充分表征的细胞或组织，每批取样... ...性能，并经常使用的控制和基准化学品提供保证检测性能的一致性 “（9） 。除下文所述的检测验收标准，每个生产批号的表皮是对一个额外的基准化学制造商（1％Triton X - 100的的）测试的质量控制。需要的曝光时间，以减少组织的生存能力，50％Triton X - 100的的决心（ET - 50）。对于表皮，ET - 50年均值从5.9小时到7.5小时不等。自1996年以来，很多很多CV为阴性对照组织（即基线可行性的变异）下平均每年7.5％。 ET50值每批产品必须属于2标准偏差，以历史平均水平，成立于1996年（即ET - 50 = 6.7小时;接受度较低限额= 4.8h;上接受限制= 8.7h）TRITON X - 100 ET50被释放的制造商使用。
EPI - 200 -薛检测验收标准1：阴性对照：
绝对负对照组（NC）组织中的MTT测试（与无菌DPBS处理）的外径是在测试实验室中获得后，运输和储存的程序和特定的使用条件下的组织活力的一个指标。检测符合验收标准，如果平均外径 570数控组织是≥1.0和≤2.5 。
EPI - 200 - 2薛检测验收标准：阳性对照
作为阳性对照（PC）的5％的SDS（H 2 O）的解决方案是使用和测试与试品同时。并行的手段，要在每个检测测试，但不超过一台电脑是每个测试日的PC。阳性对照的可行性，应在95％置信区间的历史数据。检测符合验收标准，如果PC的组织平均可行性表示为阴性对照组织中的％20％。
EPI - 200 -薛检测验收标准3：标准偏差（SD）
预计从3单一组织所确定的平均可行性皮肤刺激性和组织的变化，因此复制应该是可接受的低水平。检测符合验收标准，如果从个人组织存活率相同处理的3％计算的SD复制<18％。
代表性的成果
Discussion
在这段视频中，我们表现出的表皮皮肤刺激性试验（表皮薛）的化学品，包括化妆品和药品的成分在体外皮肤刺激测试开发和验证。执行此方法时，重要的是，在无菌条件下工作，并严格遵循验证协议，因为从协议的偏差可能会导致不同的结果。检测了一些修改是可能的，然而，协议的变化应直接讨论与作者。
这种方法唯一的限制是一个与MTT端点的测试物质可能会干扰。一个彩色的测试物质或直接降低MTT法（从而模仿脱氢酶活性的细胞线粒体）可能会干扰与MTT终点。然而，这些试验物质是一个问题，只有在MTT试验（即42小时后测试物质的暴露）足够数量的测试物质时间上仍存在（或）组织。在这不太可能发生，（真）代谢MTT还原和贡献，一个彩色的测试材料或测试材料（假）详细介绍了在检测标准作业程序提供一个程序可以通过量化的直接MTT还原的情况下MatTek公司
Acknowledgments
作者想感谢参与国际多中心验证研究修改表皮坐（5 ZEBET BfR的（德国），巴斯夫（德国），IIVS公司（美国），说＆劳基法（奥地利） ）。
References
- Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. ngrid, Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests. ALTEX. 21, 107-114 (2004).
- Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test. ATLA. 33, 351-367 (2005).
- Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication. ATLA. , Forthcoming (2009).
- Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H. The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA. 35, 559-601 (2007).
- Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances. Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Schäfer, M. R., Schäfer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kandárová, H. 15th Congress on Alternatives to Animal Experimentation, 2008 September 19-21, Linz Austria, , (2008).
- United Nations. Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS). , Second revised edition, UN. New York and Geneva. (2007).
- ESAC. Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing. , ESAC. (2008).
- Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers. Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).
- Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice. Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).
